摘要
组蛋白去甲基化酶在牙髓干细胞的成牙分化功能调节中发挥重要作用。牙髓干细胞的成牙分化调控是实现组织工程学牙再生的关键，对组蛋白甲基化水平的修饰可有效改变牙髓干细胞的成牙分化能力，其中组蛋白去甲基酶是研究的核心所在。在组蛋白去甲基化酶KDM4亚家族中KDM4D占据着特殊的地位，其仅包含JmjC及JmjN结构域，可受到多种蛋白的影响，对干细胞的成牙向分化有着显著作用，然而对于调控蛋白的结合机制尚不明了。寻找调控蛋白与KDM4D结合的位置即为尚待解决的核心科学问题，前期研究表明，KDM4D通过与特定蛋白质结合行使调控下游基因分化作用，因此明确KDM4D所受到的特殊调控过程至关重要，本研究将探究RPS5与KDM4D的何种结构域结合，并在牙髓干细胞在成牙分化过程中的作用。为牙髓干细胞介导的组织工程学牙本质再生过程提供依据。 目的: 1.本研究明确组蛋白去甲基化酶KDM4D对牙髓干细胞成牙功能的的调控作用; 2.本研究明确成牙分化过程中KDM4D通过何种结构域与RPS5结合及对功能的影响。 研究内容: 1.KDM4D在牙髓干细胞成牙分化中的功能研究:构建敲除/过表达KDM4D牙髓干细胞模型，检测KDM4D成牙分化指标变化，明确KDM4D在成牙分化中作用。 2.KDM4D在牙髓干细胞成牙分化过程中与RPS5共结合机制研究:检测KDM4D下游基因表达，构建KDM4D与RPS5结合模型，建立KDM4Ddeletion模型，检测其与RPS5结合能力并检测KDM4D成牙能力改变。 材料与方法: 1.功能研究:KDM4D慢病毒shRNA敲低DPSCs内KDM4D的表达;KDM4D慢病毒全长表达质粒转染DPSCs进行获得性功能实验:碱性磷酸酶、茜素红-钙离实验、PCR实验检测矿化基因OCN表达，检测牙髓干细胞成牙分化能力;PCR实验检测下游基因CNR1mRNA水平表达; 2.机制研究:计算机模拟KDM4D与RPS5可能结合位点，构建不同突变型DPSCs模型，CO-IP实验检测KDM4D与RPS5结合能力改变，碱性磷酸酶、茜素红-钙离实验、PCR实验检测矿化基因OCN表达，检测牙髓干细胞成牙分化能力;PCR实验检测下游基因CNR1mRNA水平表达。 结果: 1.KDM4D表达上升具有促进DPSCs成牙分化功能并上调了下游基因CNR1表达:在敲除KDM4D牙髓干细胞模型中，碱性磷酸酶、茜素红-钙离子实验、PCR实验证明敲除KDM4D可以抑制牙髓干细胞成牙向分化，过表达KDM4D牙髓干细胞模型中，碱性磷酸酶、茜素红-钙离子实验、PCR实验证明过表达KDM4D可以促进牙髓干细胞成牙向分化。在过表达KDM4D牙髓干细胞中，Real-timeRT-PCR实验表明CNR1mRNA表达增加，证明KDM4D表达增加促进去甲基化过程，促进CNR1转录过程，促进CNR1表达增加。 2.KDM4D在274aa-280aa氨基酸中与RPS5存在结合作用，并调控了牙髓干细胞成牙分化能力下降:通过对于KDM4D的计算机模拟及与RPS5的CO-IP实验，确定KDM4D在274aa-280aa与RPS5存在结合位点，KDM4D通过JmjC结构域与RPS5结合启动去甲基化过程。对于KDM4D274aa-280aa的突变型进行碱性磷酸酶、茜素红-钙离子实验、PCR实验，证明该结构域突变后成牙分化能力降低，Real-timeRT-PCR实验表明CNR1mRNA表达降低，证明KDM4D274aa-260结构域突变后，降低CNR1转录能力并影响牙髓干细胞成牙功能。 结论: 1.本研究发现KDM4D具有诱导牙髓干细胞成牙向分化，并促进了下游基因CNR1表达; 2.KDM4D可与RPS5通过JmjC的结构域的274aa-280aa位点结合，参与KDM4D在牙髓干细胞成牙作用的调控，改变KDM4D的成牙分化能力。
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