摘要
目的:癫痫是脑神经元异常放电引起的以反复痫性发作为特征的一种慢性脑功能失调综合征。目前大约30％的患者通过合理的药物治疗仍不能有效控制癫痫发作，成为难治性癫痫（intractableepilepsy,IE）。研究发现局灶性皮质发育不良（focalcorticaldysplasia，FCD）是儿童IE最常见的病因病理，其中FCDⅡ型所占比例最高，组织学上具有特征性形态异常神经元（dysmorphicneuron,DN）和气球细胞（ballooncell，BC）。长期癫痫相关肿瘤是IE第二常见的病理类型，以节细胞胶质瘤（gangliogliomas，GG）为主。GG中神经元成分表现为发育不良神经元形态，周边常常伴发FCD。由于FCDⅡ及GG病灶内异常细胞成分均存在mTOR信号通路的异常激活，因此被统称为mTOR病。本研究聚焦于FCDⅡ和GG来探讨IE的分子病理机制。近年来研究发现30％FCDⅡ病灶内存在mTOR信号通路相关基因的突变，但仍有70％左右FCDⅡ病变未检测到基因水平的改变，其发生和致痫分子机制尚不清楚。本论文主要利用空间转录组技术构建FCDⅡb的空间转录图谱，进一步探究FCD异常细胞发生和致痫的关键分子机制。此外，GG最常见的基因改变是BRAFp.V600E突变，但在我国有关GG尤其是BRAF野生型GG的分子遗传学概况目前也是知之甚少，我们将综合分析GG的临床、病理及分子遗传学特征，为癫痫发病的分子机制探讨及药物治疗的新靶点开发提供线索。 方法: 1.收集2014年1月至2021年6月期间，经首都医科大学宣武医院神经外科手术切除治疗的IE患者脑组织标本，根据临床、影像学特点和病理学诊断进行病例筛选，入组3例FCDⅡb患者（平均发病年龄11.7岁）及30例GG患者（平均发病年龄8岁），并进行术后随访。 2.选取3例FCDⅡb新鲜标本(包含3例病灶，1例灶旁)，利用空间转录组技术构建FCDⅡb空间转录图谱，聚焦于特征性的DN及BC亚群，通过亚群间及病灶-灶旁的差异比较，筛选差异表达基因。进一步通过GO、KEGG和GSEA富集分析揭示相关基因参与的生物学过程及信号通路。3.从30例GG石蜡标本中提取DNA后采用靶向131基因进行高通量测序(NovaSeq6000)。其中三例GG组织学存在异质性，对其不同组织学特征成分进行分别测序。最终综合病例的临床-病理-分子特征进行基因型-表型相关性分析。 结果: 1.FCDⅡb的空间转录组研究 1)通过亚群聚类注释，结合组织形态学细胞所在空间位置，我们鉴别出Cluster0亚群对应于DN区域，Cluster3亚群对应于BC区域。筛选出DN及BC区域相应的差异高表达基因。 2)DN区域的差异高表达基因主要参与膜电位调节、突触、微管、细胞发育和形态调节、自噬及泛素蛋白酶体系统等生物学过程，并在泛素介导的蛋白质水解、蛋白酶体、mTOR信号通路及磷酸肌醇信号传导途径中作用显著。与其他亚群相比，Cluster0亚群在突触后膜电位的调节方面显著富集，与神经活性配体受体相互作用通路有关。与灶旁组织相比，病灶Cluster0亚群主要与自噬、膜电位调节等生物学过程有关。 3)BC区域的差异高表达基因主要参与胶质细胞分化、肌动蛋白丝调节、细胞发育和形态调节、补体激活、免疫炎症反应和自噬的负性调控等生物学过程，并在肌动蛋白细胞骨架的调节和抗原加工和呈递等通路中作用显著。与星形胶质细胞区域对比，Cluster3亚群主要与免疫炎症反应及补体激活相关。同样，与灶旁组织相比，病灶Cluster3亚群主要参与免疫炎症反应及补体激活等生物学过程。 4)相较于灶旁组织,病灶中DN及BC区域均存在GFAP、SPARC、SERPINA3、CHI3L1、SPP1、PLP1、CD74、CRYAB、IGFBP7等基因高表达的情况，这些基因共同参与中枢神经系统发育和细胞形态调节等生物学过程。 2.GG的高通量测序及基因型-表型相关性分析 1）77％的GG中检测出基因突变（23/30）,其中BRAFp.V600E突变最为常见（20例）。另外三个病例分别检测出KRASp.Q22R和KRASp.G13R突变、IRS2拷贝数增加（CNG）以及KIAA1549-BRAF融合。在对同一肿瘤的不同组织学特征成分进行研究时，我们发现在1例GG伴PXA特征的两种成分中均存在BRAFp.V600E突变，PXA成分另伴有CDKN2A/B纯合缺失;在1例GG伴发DNT样结构的两种成分中均存在IRS2CNG;在1例有少突胶质细胞瘤样特征的GG的两种成分中均发现BRAFp.V600E突变和7号染色体获得。 2）临床随访结果显示24例GG均未发生肿瘤进展（6例失访），但9例出现术后癫痫复发情况，并且癫痫复发与非典型组织病理特征（GG伴有高ki-67增殖指数或PXA的组织学成分）有明显的相关性（p=0.0474*）。 结论: 1.本论文发现FCDⅡb中DN区域与mTOR信号通路、自噬以及泛素蛋白酶体系统等有关，可能是FCD形态异常细胞发生的分子基础;同时推测其主要通过调节膜电位参与癫痫异常放电。BC区域可能主要通过介导补体激活及免疫炎症反应等参与FCD疾病进程。DN及BC区域可能共同介导中枢神经系统发育和细胞形态调节等进而调控FCD疾病的发生发展。 2.GG主要通过BRAFp.V600E突变等激活MAPK激酶途径调节肿瘤的生长增殖。此外，我们发现同一肿瘤不同组织特征成分携带不同的基因改变，表明可能存在复合性节细胞胶质瘤的特殊亚型，并有向高级别转化的可能性。伴有非典型组织病理特征的GG与癫痫复发具有相关性，为癫痫发病的分子机制的探讨及临床个体化诊疗方案的制定提供依据。
NETL