摘要
背景脑出血(intracerebralhemorrhage，ICH)是血管破裂所致的脑实质内出血，致死致残率高，探讨脑出血治疗的大型临床研究均为阴性结果，目前缺乏有效的治疗方法。血肿造成原发性和继发性损害，是导致患者预后不良的重要原因，因此促进血肿清除是ICH治疗的关键靶点。既往研究显示将血肿体积降低到一定阈值可以带来临床获益，但传统外科开颅手术创伤大，微创手术血肿清除不彻底。除外源性血肿清除措施外，提高机体内源性血肿清除的能力可进一步加快血肿吸收。远隔缺血适应(Remoteischemicconditioning,RIC)是一种物理治疗措施，其脑保护作用已被广泛证实。既往研究发现，RIC在脑出血动物模型中应用安全可行，不增加血肿扩大风险，但RIC能否提高脑出血小鼠内源性血肿清除能力、促进血肿清除、改善临床预后及其作用机制还需进一步研究验证。 目的探讨RIC对ICH血肿清除的作用及其潜在的作用机制，并探讨RIC对急性脑出血患者的安全性和初步临床有效性。 方法1.首先，构建胶原酶ICH模型，通过脑组织直接切片、小动物核磁和脑干湿重法分别检测血肿和水肿体积，通过多种行为学方法评估各个时间点神经功能缺损情况，明确RIC对胶原酶ICH的保护作用，通过高通量蛋白芯片比较对照组和RIC组脑组织差异表达的蛋白，发现RIC作用的潜在靶点AXL。随后，在野生型(WT)及AXL基因敲除(KO)小鼠中构建自体血ICH模型，通过血肿体积、Drabkin''s溶液检测血红蛋白含量、普鲁士蓝染色检测铁离子沉积来综合评估血肿情况，通过多种行为学方法评估神经功能缺损情况，明确AXL是否介导RIC对自体血ICH模型的保护作用。通过免疫荧光染色评估小胶质细胞胞葬作用及胞葬通路相关蛋白的表达，明确AXL是否介导RIC对小胶质细胞胞葬功能的影响。最后，提取WT和KO乳鼠原代小胶质细胞分离培养，RIC组提前给予间断氧糖剥夺模拟RIC治疗，加入PKH-26荧光染料标记的红细胞共孵育构建体外ICH模型，通过免疫荧光染色评估小胶质细胞对红细胞的胞葬作用，进一步证实RIC对小胶质细胞胞葬功能的影响。 2.进行多中心、随机、对照临床试验，招募40名发病后24-48小时内的幕上脑出血患者，随机分配至标准药物治疗组或RIC组，RIC组患者在接受标准药物治疗的基础上联合RIC治疗，RIC治疗通过远隔缺血适应治疗仪进行，每天一次，连续7天。主要安全性结局指标为入组后7天内神经功能恶化的发生率，主要有效性结局指标为计算机断层扫描（computedtomographyscan,CT）图像上血肿体积的变化。其他安全性和有效性结局指标包括90天内死亡和RIC相关严重不良事件的发生率、7天时的血肿清除率（[7天时的血肿体积-基线时的血肿体积]/基线检查时的血肿体积）、绝对血肿周围水肿（perihematomaledema,PHE）、相对血肿周围水肿（relativePHE，定义为PHE/血肿体积）和90天时的功能预后（通过改良Rankin评分量表[mRS]评估）。 结果1.RIC促进胶原酶ICH模型血肿清除、抑制水肿形成、改善了远期神经功能，明确了RIC对小鼠胶原酶ICH的保护作用。发现RIC导致脑组织多种蛋白表达水平发生改变，涉及多种信号通路，发现血肿清除的潜在靶点AXL。进一步在自体血模型中对WT和AXLKO小鼠的实验发现，RIC降低了WT小鼠血肿体积、血红蛋白含量、减轻铁离子沉积、改善了远期神经功能，但RIC的保护作用在AXLKO小鼠中减弱或消失，说明RIC的保护作用依赖于AXL。RIC促进了小胶质细胞对红细胞的胞葬作用及胞葬通路相关蛋白的表达，增强了其胞葬功能作用，且RIC对胞葬的促进作用在AXLKO小鼠中减弱或消失，综上说明RIC通过AXL介导的小胶质细胞胞葬促进血肿清除、改善神经功能预后。体外实验显示RIC模拟促进野生型原代小胶质细胞对红细胞的胞葬作用，对AXLKO的小胶质细胞胞葬作用无显著影响，进一步证实RIC对小胶质细胞胞葬功能的促进作用依赖于AXL。 2.研究共招募40名受试者，所有受试者均完成随访，入组患者的平均年龄为59.3±11.7岁，血肿体积为13.9±4.5mL。入组后7天内无患者出现神经功能恶化、死亡或RIC相关严重不良事件。基线时，对照组血肿体积为14.19±5.07mL，RIC组为13.55±3.99mL，7天时对照组血肿体积为8.54±3.99mL,RIC组为6.95±2.71mL,差异没有统计学差异（p值均大于0.05）。但RIC组血肿清除率显著高于对照组（49.25±9.17％比41.92±9.14％;平均差值为7.3％;95％可信区间[Confidenceinterval,CI]为1.51-13.16％;p=0.015）。7天时绝对PHE在对照组和RIC组分别为17.27±8.34mL和12.92±7.30mL,两组间差异不显著（p=0.087），但RIC组相对PHE显著低于对照组（1.77±0.39比2.02±0.27;平均差值为0.25;95％CI为0.39-0.47;p=0.023）。在90天的随访时，RIC组有13名受试者（65％）达到了功能独立（mRS≤3分），对照组有12名（60％），两组间差异不显著（p=0.744）。 结论本研究在两种不同的小鼠ICH模型中，证实了RIC能够促进血肿清除、减轻铁离子沉积、改善远期神经功能，通过高通量蛋白芯片筛选两组差异表达的蛋白，发现潜在靶点AXL,引入AXL基因敲除小鼠，证明了RIC对ICH的保护作用依赖于AXL介导的小胶质细胞胞葬。在体外ICH模型中，进一步证实RIC增强了原代小胶质细胞对红细胞的胞葬作用。在急性脑出血患者中，连续7天每天重复RIC治疗是安全的，患者耐受性良好。RIC可能能够促进脑出血血肿清除、抑制相对PHE。RIC作为一种安全、简便易行、有效的治疗措施，临床转化可行性高，本研究为RIC对ICH患者的治疗有效性提供了理论依据并进行了初步探讨，值得进行进一步的临床转化研究。
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