摘要
实验目的 牙周炎是当今最紧迫的口腔健康问题之一。牙周炎骨丧失是病原微生物引起的直接损伤及宿主免疫应答引起的间接损伤共同作用的结果。先前研究显示，间充质干细胞对免疫细胞如巨噬细胞和淋巴细胞具有负向免疫调节作用。外泌体是旁分泌的细胞外囊泡之一，它不仅能够诱导间充质干细胞的成骨分化和局部骨再生，而且能够通过扭转炎症与免疫反应的失调，从宿主免疫水平抑制炎症的进展，为牙周炎的治疗提供了一种新的思路。近期研究指出，分泌IL-10的调节性B细胞(B10细胞)在抑制牙周炎症方面发挥重要作用。因此，本研究探索了小鼠骨髓干细胞外泌体对B细胞极化为B10细胞的影响，为进一步将外泌体用作诱导B10产生及用于治疗牙周炎的无细胞疗法提供了科学依据。 实验方法 本研究从小鼠股骨及胫骨中提取骨髓干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs),进行体外培养及扩增传代。采用超滤及试剂盒相结合的方法从细胞上清中提取骨髓干细胞源性外泌体(bonemarrowmesenchymalstemcellsderivedexosomes,BMMSCs-Exo)并使用透射电镜、纳米颗粒追踪分析及蛋白印迹法对其进行鉴定。采用免疫磁珠法将从小鼠脾脏中提取的脾细胞分离纯化为B细胞。在预刺激B细胞的同时，实验一中将B细胞与BMMSCs通过transwell共培养，实验三中将B细胞与不同浓度BMMSCs-Exo共孵育，通过CellCountingKit-8(CCK-8)实验检测细胞的增殖活性;采用实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-TimeQuantitativeReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,qRT-PCR)、酶联免疫学实验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测炎症相关因子IL-1β、TNF-α、RANKL、OPG、IL-10的基因表达以及IL-10蛋白分泌水平的变化;采用流式细胞术检测CD1dhighCD5+Breg细胞数量占比的变化。 实验结果 从传代培养的BMMSCs上清液中分离得到的外泌体具有典型的茶托或杯口状外观，粒径峰值为97.9nm,占比97.7％,粒径均值为120.5nm。经鉴定，BMMSCs-Exo表达阳性蛋白标志物CD9、CD63、CD81,对Calnexin蛋白呈阴性表达。BMMSCs-Exo与B细胞体外共孵育24h时，免疫荧光结果显示BMMSCs-Exo被B细胞摄取。BMMSCs-Exo与B细胞体外共孵育72h后，与对照组相比，BMMSCs及BMMSCs-Exo共培养实验组都显示CD1dhighCD5+Breg细胞的占比增加。然而，BMMSCs共培养组B细胞增殖效果明显，而BMMSCs-Exo及BMMSCs条件培养基(bonemarrowmesenchymalstemcellsderivedconditionalmedium,BMMSCs-CM)实验组B细胞增殖受到抑制。与对照组相比，两种共培养组中炎症相关因子IL-1β、TNF-α,骨代谢相关基因RANKL、OPG的表达量均下调，而IL-10的表达与分泌在与BMMSCs共培养时升高，在与BMMSCs-Exo共培养时则下降。BMMSCs-Exo浓度梯度的实验显示，B细胞表型转化比例随外泌体浓度的增加持续升高，而IL-10的表达与分泌下调与外泌体浓度无明显相关性。 实验结论 一定浓度范围内的BMMSCs-Exo能够促进B细胞转化为CD1dhighCD5+Breg细胞(B10细胞)，但不能促进其体外分泌IL-10。
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