摘要
谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）是一株生物安全且具有重要工业应用价值的底盘微生物，被广泛的应用于生产各种氨基酸、有机酸、芳香族化学品等。目前，谷氨酸棒杆菌中已报道多种具有不同强度的表达调控元件，并应用于代谢途径改造中，提高了目标产物的合成。但是，对于多基因的表达调控，由于谷氨酸棒杆菌中缺乏有效的多基因编辑工具，目前只能依赖于迭代基因组编辑，极大的增加了改造难度与周期。近年来新兴的碱基编辑技术可以实现多位点的同时编辑，为解决上述问题提供了研究思路。本论文将碱基编辑技术应用于谷氨酸棒杆菌的启动子5’UTR（promoter5’UTR，PUTR）的改造中，获得了具有不同强度变化的PUTR突变体库，再结合多位点碱基编辑技术，实现了对目标产物代谢途径多基因的同时表达调控。本论文的主要研究结果如下： （1）本论文结合SpRY、SpG、ScCas9++三种新型PAM宽松的Cas突变体，实现对谷氨酸棒杆菌中胞嘧啶碱基编辑工具的PAM拓展。结果显示，结合SpRY突变体具有更宽松的PAM识别，但整体编辑效率较低，结合SpG突变体可实现对所有NGN种类PAM位点的编辑，但对NGGPAM位点的编辑，相比原始Cas9蛋白，编辑效率下降9.3-55.9%，结合ScCas9++突变体，除对TCG，CTGPAM没有识别外，可实现对其他NNGPAM位点的编辑，且编辑效率整体较高，最高可达100%； （2）将碱基编辑工具应用于PgroUTR突变中，并建立基于GFP蛋白的表征系统，以实现对不同突变体表达强度的表征。结果显示：PgroUTR突变体4-1、3-1、4-3、10-8分别提高了4.9倍、2.7倍、2.6倍和1.6倍，突变体12-1和12-2都下降了20%，该结果表明，碱基编辑技术介导的PUTR突变，可以生成具有不同表达强度变化的PUTR突变体； （3）为实现对谷氨酸合成代谢途径的多基因表达调控，选择谷氨酸合成途径相关基因gdh（cgl2079）、pyc（cgl0869）、gltA（cgl0829）、MscCG（cgl1270）和ppc（cgl1585）的PUTR进行改造，分别构建它们的PUTR突变体文库并对其表达强度进行了表征，获得了具有研究意义的PUTR突变体； （4）将上述基因的PUTR突变体应用于谷氨酸的多基因同时表达调控中，研究其对谷氨酸产量的影响。首先对pyc、gltA、ppc基因进行单基因强化调控，相比野生型，谷氨酸产量没有提高；然后，对pyc、gltA两个基因做同时强化调控，相比野生型，谷氨酸产量没有提高；最后，对pyc、gltA、odhA基因进行三基因的同时调控，然而未能编辑获得期望的基因型。 本论文的开展对其他基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑工具的PAM拓展提供有利的参考，为谷氨酸棒杆菌中的多基因表达调控提供了一种全新的解决思路。
NETL