摘要
芽孢杆菌（Bacillus）是一类能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌，因其具有净化水体、抑制蓝藻生长以及促进养殖动物生长的功能，常被用作水产养殖系统中的有益微生物。本研究从凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）养殖水体中筛选得到两株具有高效产酶、高效降解亚硝态氮和抑制蓝藻等功能的芽孢杆菌，结合生理生化指标、分子生物学方法和亚显微技术，将菌株鉴定到种，并对筛选菌株进行全基因组测序及相关基因的验证，同时进行了多功能芽孢杆菌在凡纳滨对虾养殖上的试验。主要研究结果如下： 1、从凡纳滨对虾养殖水体中筛选得到两株高效降解亚硝酸盐菌株，分别命名为AP3和NCG1，经菌株的生理生化指标测定、菌株的亚显微形态观察、16SrDNA基因序列分析，鉴定菌株AP3为贝莱斯芽孢杆菌，菌株NCG1为枯草芽孢杆菌。 2、以温度、pH和盐度为指标，采用单因素和Box-Behnken响应面设计实验，优化菌株AP3生长、亚硝酸盐去除、淀粉酶和蛋白酶产生及NCG1生长和亚硝酸盐去除条件，结果表明：温度为34.5℃、pH为7.1和盐度为5.6时，AP3菌株生长最佳，OD600为2.099；温度为34.9℃、pH为7.2和盐度为8.0时，亚硝酸盐去除效果最佳，去除率为98.04%；温度为33.3℃、pH为7.8和盐度为7.0时，AP3菌株淀粉酶活性最大，酶活力0.93U/mL；温度为33.8℃、pH为7.0和盐度为4.3时，AP3菌株蛋白酶活性最大，酶活力418.47U/mL。温度为34.6℃、pH为6.9和盐度为7.7时，NCG1菌株生长速度最快，OD600为1.908；温度为34.8℃、pH为6.7和盐度为10.5时，NCG1菌株去除亚硝酸盐效果最佳，去除率为98.27%。 3、菌株AP3和NCG1的抑藻效应结果表明：菌株AP3菌体和无菌滤液的抑藻率分别为76.51%和80.02%，菌株NCG1菌体和无菌滤液的抑藻率分别为58.84%和79.31%，此外，菌株AP3和菌株NCG1的无菌滤液均能显著抑制铜绿微囊藻叶绿素a的合成，并显著下调铜绿微囊藻光合作用相关基因（PSBA和rbcL）的表达水平，推测菌株通过抑制铜绿微囊藻光合作用，抑制其生长。 4、通过ONT测序平台完成了菌株AP3的全基因组测序以及生物信息学分析。AP3全基因组由1条3,929,786bp的环状染色体和1个88,966bp的质粒组成，GC含量为46.48%。将菌株AP3的全基因组数据提交至NCBI数据库，登彔号为CP094294-CP094295。AP3基因组共有3866个蛋白质编码基因，与菌株AP3氨基酸代谢和核苷酸代谢相关基因分别有289和78个。经KEGG数据库注释，发现有18个基因可能与亚硝酸盐代谢有关，其中3个基因编码亚硝酸盐还原酶，2个基因参与亚硝酸盐转运，5个基因参与亚硝酸盐代谢。全基因组测序、RT-PCR和qRT-PCR技术对菌株亚硝酸盐去除途径进行分析，确定菌株AP3存在gudB、gLDT、NirD、Nark和glnA基因，菌株NCG1存在Nirs、Nor和Nos基因与亚硝酸盐去除相关，推测菌株AP3和菌株NCG1去除亚硝酸盐的途径分别为DNRA途径和反硝化途径。 5、将菌株AP3和菌株NCG1（1∶1）菌剂以0.1%的添加量与凡纳滨对虾饲料原料混合，加工制作成功能性生态饲料，进行凡纳滨对虾养殖试验，对照组不添加芽孢杆菌菌剂，每天按照对虾体质量的4-5％投喂饲料，养殖实验持续95d。试验结束后，分别检测凡纳滨对虾生长和消化指标，抗氧化酶活性，肠道菌群结构，以及养殖水体亚硝酸盐含量。结果表明：芽孢杆菌明显提高凡纳滨对虾体增重、成活率以及肠道菌群的物种丰富度和多样性，显著提高凡纳滨对虾肝胰腺、胃和肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性以及肝胰腺抗氧化酶活性，明显降低凡纳滨对虾饲料系数，显著降低养虾水体的亚硝酸盐含量。
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