摘要
大肠杆菌作为模式菌株和工业生产菌种应用领域不断拓展，需要进一步改造细胞底盘以满足工业化生产和科学研究的需求。脂多糖作为大肠杆菌细胞外膜的主要组成部分，其合成过程与细胞外膜功能关系密切。系统研究脂多糖合成量变化对细胞外膜功能影响，有助于指导优良工业大肠杆菌菌种的选育。本研究利用Red同源重组系统，通过叠加删除与脂多糖减量合成相关的部分基因，构建脂多糖减量合成的新菌种，对比了细胞个体形态和菌落群体形态与出发菌株的差异性变化，进而系统评价了脂多糖减量合成对细胞外膜功能的影响，具体包括细胞外膜渗透性、菌体细胞自凝集特性和细胞代谢性能等外膜功能的影响。本文的主要研究结果如下： （1）采用RED同源重组系统成功叠加删除了脂多糖合成相关的部分基因，构建了脂多糖减量合成的新菌种。采用重叠PCR将脂多糖转运蛋白的编码基因msbA第148位C碱基替换为T碱基，获得了脂多糖转运蛋白第52位脯氨酸替换为半胱氨酸的编码基因msbA148。将msbA148基因克隆于启动子PamyL下游和终止子TamyL上游后，以lldD基因为靶点，利用RED同源重组系统将表达盒PamyL-msbA148-TamyL整合于出发菌株LG101染色体上同步删除了lldD基因，获得了重组菌LGLM。在此基础上，叠加删除了核心多糖内核心部分合成相关基因kdsD，脂质A脂肪酸链修饰相关基因以及磷酸基团修饰相关基因lpxL、pagP、lpxP、eptA和lpxM，成功构建了脂多糖减量合成的系列突变菌株LGL4A01、LGL4A02、LGL4A03、LGL4A04、LGL4A05、LGL4A06； （2）采用固体平板培养和显微镜镜检方式，考察了突变菌株LGL4A06与出发菌株相比较细胞个体形态和菌落群体形态的差异性，以及摇瓶培养条件下的生长差异性。LB固体平板培养显示，突变菌株LGL4A06巨大菌落培养24h呈现显著的菌体聚集现象，培养48h呈现明显的分层状。出发菌株LG101相同培养条件下菌落形态未见明显菌落聚集。进一步显微镜检测显示，出发菌株LGL101细胞形态呈现短杆状，细胞群体呈分散状；突变菌株LGL4A06细胞形态呈现长杆状，细胞群体呈聚集状；液体摇瓶培养显示，突变菌株LGL4A06在LB和M9培养基中分别培养均在11h达到最大菌体量（OD600分别为3.55和3.28），相同条件下出发菌株LGL101在LB和M9培养基中分别培养8h和9h达到最大菌体量（OD600为3.53和3.20）。可见，相同培养条件下，突变菌LGL4A06可获得与出发菌株相当的菌体量，但比生长速率在LB培养基和M9培养基中分别降低了32.26%（0.93h-1/0.63h-1）和42.47%（0.73h-1/0.42h-1）。 （3）系统评价了脂多糖减量合成对细胞外膜功能和代谢性能的影响。通过改良的微量热酚水解法评价了出发菌株LGL101和突变菌株LGL4A06的脂多糖合成情况，结果显示突变菌株LGL4A06的单细胞脂多糖合成水平较出发菌株降低了39.34%，同时，细胞干重也较出发菌株降低了32.46%；细胞外膜渗透性评价显示，相对于出发菌株LGL101，突变菌株LGL4A06外膜渗透性提高了30%以上。此外，突变菌株LGL4A06在液体培养体系下呈现了显著的自凝集特征，12h自凝集率较出发菌株LGL101提高了13.9倍。钙离子辅助下，突变菌株LGL4A06静置4h自凝集率达95%以上（出发菌株相同条件静置12h自凝集率仍不足7%）；5L发酵罐培养显示，突变菌株LGL4A06在相同碳源添加量下可积累与出发菌株LG101一致的生物量（10.05g/L/9.84g/L），比生长速率降低了32.63%（0.95h-1/0.64h-1）。厌氧发酵条件下，相同碳源添加量，突变菌株LGL4A06糖酸转化率较出发菌株提高了6.03%（90.91%/96.74%），产酸速率降低了15.28%（6.15g/L·h/5.21g/L·h）。发酵结束后，突变菌株LGL4A06菌体可在不外加絮凝剂的条件下，10min内完成沉降，上清液中菌体残留率低于3.15%，而出发菌株菌体残留率为99.27%。研究结果证实，脂多糖减量合成对细胞外膜功能的影响，特别是自凝集率的提高有助于指导大肠杆菌规模化生产体系中菌体收集新工艺的开发。
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