摘要
出芽短梗霉（Aureobasidiiumpullulans）是一种类似酵母的真菌，广泛存在于自然界中，研究表明其具有产多种代谢产物的能力，在工业领域有重要应用。微生物胞外多糖是微生物产生的功能性物质，可维持自身生长及适应外部环境，其具有的生物活性与多糖的单糖组成、糖苷键种类、连接位置等有关。本实验室前期诱变得到一株不产黑色素的出芽短梗霉，并保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC23063。本课题此菌株为出发菌株研究了其生物学信息、发酵培养基以及其胞外多糖的分离纯化和结构解析、免疫活性和抗肿瘤机制，研究结果如下： （1）对出芽短梗霉CGMCC23063进行全基因组二代测序，其基因组全长为25.41Mb，含CDSs1859个，Scaffold161个，通过对基因组注释得到，与多糖合成的代谢途径主要是淀粉和蔗糖代谢途径、氨基糖和核苷酸糖代谢途径，并且参与到了多糖合成与运输过程。通过DFVF数据库注释，预测的毒力因子没有直接参与或编码毒素物质，血平板试验也证明了此菌株不具有溶血性。以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、乳糖为碳源，出芽短梗霉CGMCC23063多糖产量不同，其中以蔗糖为碳源时多糖产量最高；以稻糠、豆粕、玉米浆、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠为氮源，发现其不能利用无机氮源进行产糖，利用稻糠作为氮源时多糖产量最高；通过单因素实验与正交实验得到以蔗糖为碳源、稻糠为氮源、初始pH值6.0为产糖最佳培养基，并通过5L发酵罐进行放大发酵验证得到粗多糖产量达到了13.42g/L。稻糠不仅可以作为氮源，并可提供矿物质等营养物质，减少外源物质添加。 （2）采用优化的发酵培养基，进行出芽短梗霉CGMCC23063发酵，发酵结束后将发酵液进行醇沉，得到胞外粗多糖，粗多糖总糖含量为69.26±2.46%，蛋白质含量为12.75±1.97%，经三氯乙酸除去蛋白后，依次用DEAE-650M阴离子交换柱和葡聚糖凝胶G-100进行分离洗脱，得到唯一纯化组分（命名为EPS-1），测得其总糖含量为93.96±0.82%，不含核酸和蛋白质，分子量为294.95kDa，是具有分支结构和三股螺旋结构的非淀粉多糖；通过红外光谱和离子色谱测得EPS-1是一种β-葡聚糖；通过多糖甲基化和核磁共振波谱分析得到，EPS-1的结构由β-(1,3)-葡聚糖作为主链，单个β-(1,6)-葡萄糖作为分支组成。圆二色谱测定及扫描电镜和原子力显微镜观察得到EPS-1是按照三股螺旋聚集成球后再形成链状和环状结构。热重结果显示EPS-1在290℃以下相对稳定。将出芽短梗霉胞外多糖EPS-1与另外两种不同来源的β-葡聚糖进行结构对比得到，在总糖含量方面，EPS-1为93.96±0.82%，酵母葡聚糖为90.42±2.54%，细菌β-葡聚糖为78.95±2.66%；三种多糖均含有β-糖苷键，且EPS-1、酵母葡聚糖主要由葡萄糖构成，而细菌β-葡聚糖则由葡萄糖和半乳糖组成；甲基化分析得到EPS-1的糖苷键比例与其余两种多糖均不相同，EPS-1的1,3-Glcp和1,3,6-Glcp比例为1∶0.09，酵母葡聚糖的1,3-Glcp和1,3,6-Glcp比例为1∶0.49，而细菌β-葡聚糖的糖苷键主要由1,3-Glcp、1,6-Glcp以及1,3-Galp构成，其比例为1∶0.64∶0.28。因此需要对其生物活性进行分析。 （3）以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为对象，研究出芽短梗霉CGMCC23063胞外多糖EPS-1在体外的免疫调节活性。结果显示，EPS-1能增强RAW264.7细胞的增殖能力及吞噬能力，对细胞无毒性，诱导细胞分化出伪足，并能刺激胞内ROS的产生，证明EPS-1具有激活RAW264.7细胞的能力。选取EPS-1在100-600μg/mL浓度范围内处理RAW264.7细胞，测定其培养液上清中的细胞因子含量，发现EPS-1能刺激细胞产生NO、TNF-α、IL-6的产生，含量最高分别为17.04μM、448.46pg/mL、15.18pg/mL；同时采用荧光定量PCR测定得到所有细胞因子的mRNA表达均上调；WesternBlot结果显示，与细胞因子分泌相关的NF-κB和MAPK通路中的p-p65和p-erk蛋白表达量显著增加，说明EPS-1是通过刺激这两条信号通路产生细胞因子，从而调节了细胞的免疫调节活性。 （4）以人弥漫大B淋巴瘤细胞系（SU-DHL-8）为对象，研究出芽短梗霉CGMCC23063胞外多糖EPS-1与利妥昔单抗（RIX）在体内和体外的肿瘤抑制作用。在体外实验中，EPS-1对细胞活性的抑制率为29.27%，EPS-1与RIX联用对细胞活性的抑制率为72.11%，并且细胞形态也受到很大影响；流式细胞术分析得到，EPS-1和RIX联合使用可促进SU-DHL-8细胞凋亡和坏死。通过21天的荷瘤小鼠实验，EPS-1能恢复小鼠的饮食量及体重，延缓实体瘤的生长速度，并能与RIX协同增强抑瘤效果；通过对血清细胞因子、免疫器官指数及脾淋巴细胞增殖能力的测定，EPS1在一定程度上能恢复宿主的免疫系统，增强机体免疫功能，与RIX联用具有优势；通过对肿瘤组织RNA-seq转录测序结果得到，EPS-1组与Control组对比共有347个差异表达基因，其中193个基因上调，154个基因下调，通过对涉及的基因进行RT-PCR验证以及免疫组织化学分析得到，EPS-1对肿瘤可能的作用是通过JAK-STAT信号通路，诱导T效应细胞群浸润到肿瘤微环境中，增强肿瘤微环境的免疫应答，并通过MAPK信号通路诱导促炎细胞因子，导致了肿瘤细胞凋亡。TUNEL染色及Ki67免疫荧光结果得到EPS-1不仅在一定程度上对肿瘤细胞造成了凋亡，并且能抑制肿瘤细胞的增殖；相关凋亡蛋白的表达表明EPS-1与RIX联合治疗是通过增强线粒体和死亡受体介导的凋亡通路来达到更大的抑瘤效果。
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