摘要
木质纤维素是非常重要的可再生资源，但因其结构复杂，降解效率低，利用成本高，无法发挥其潜在的应用价值。裂解多糖单加氧酶（LPMOs）是一种铜依赖性酶，它能够氧化纤维素底物的多糖链使其断裂，从而使纤维素酶能够更加有效地将其水解。本论文在已挖掘到的黑曲霉AA9家族LPMO（AnLPMO15g）基本酶学特性研究的基础上，以提高其催化活性和热稳定性为目的对该酶进行分子改造，研究优势突变体的酶学特性、底物特异性及协同降解纤维素的能力，为木质纤维素的转化提供理论依据。 通过对AnLPMO15g的结构特性分析，结合序列比对和分子对接，筛选获得了催化活性中心附近的候选突变位点S49、S90和S101，采用丙氨酸扫描进行定点突变，得到了催化效率(Kcat/Km)提高1.27倍的突变体S49A。同时，利用计算机辅助设计软件对AnLPMO15g进行模拟饱和突变，根据解折叠自由能的变化(??G)，筛选得到了8个候选突变位点，分别进行定点突变，获得了温度稳定性和pH稳定性均得到提高的突变体E185V，在最适条件下，其酶活约为野生型的1.45倍。 进一步对有义突变体进行组合突变，得到突变体E185V/Q108M/A249P，其催化效率(Kcat/Km)约为野生型的1.56倍。该突变体作用于微晶纤维素、纤维六糖、CMC和木聚糖底物时，还原糖产量分别提高了122.95%、42.2%、33.33%以及53.57%，作用于微晶纤维素、玉米芯、草粉和小麦秸秆等底物时，与纤维素酶协同作用产生的还原糖较纤维素酶单独作用时分别提高了168.5%、120.53%、185.6%和202.5%。为了探究突变对蛋白质的影响，对突变体E185V/Q108M/A249P和AnLPMO15g与纤维六糖底物的复合物进行分子动力学模拟分析，结果显示突变导致该蛋白活性表面的Loop环结构变得松散，柔性增加，更易于底物结合。 通过双质粒共表达策略使最佳突变体E185V/Q108M/A249P的蛋白质表达量提高了11.49%。在此基础上，对其进行种子接种量及添加表面活性剂的优化，最终使该突变体的表达量提高了0.85mg/L，较优化前提高了57.43%。
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