摘要
猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒引起的，以厌食、呕吐、脱水、腹泻和精神萎靡等为主要特征的高度接触性肠道传染病。其中非结构蛋白Nsp3主要编码木瓜蛋白酶，已经有研究证实其在病毒拮抗宿主的天然免疫，促进病毒感染机体中发挥着重要作用。非结构蛋白Nsp5主要编码3C样蛋白酶，据报道是一种干扰素拮抗剂，可以干扰干扰素的形成，促进病毒的增殖。PEDV的膜蛋白，M蛋白是构成病毒包膜的主要成分，可以调节宿主的先天性免疫反应。目前已经证实多种冠状病毒感染与细胞凋亡之间密切密切相关。但关于PEDV诱发细胞凋亡的研究较少，本研究通过PEDV病毒感染Vero细胞，证实了PEDV感染可以诱发细胞凋亡，为了筛选引起细胞凋亡的病毒蛋白，通过构建PEDV相关病毒蛋白真核表达质粒转染细胞，初步发现PEDV病毒蛋白Nsp3、Nsp5和M蛋白可以诱发细胞凋亡。 1、PEDV诱导Vero细胞凋亡 本研究通过在显微镜下观察，发现PEDV在感染Vero细胞后，可以观察到典型的合胞体病变现象。为探究感染PEDV不同剂量和不同时间段，PEDV与细胞凋亡之间的关系，通过Westernblot技术检测相关凋亡蛋白和PEDVN蛋白的表达量。结果表明，PEDV感染Vero细胞后期发生了caspases相关的激活反应，证明PEDV感染确实诱发了细胞凋亡。这有助于我们拓展新型抗病毒策略的研究思路，为猪流行性腹泻病毒的防控提供了一定的参考依据。 2、构建PEDV相关病毒蛋白真核表达质粒 为了明确与细胞凋亡有关的蛋白，本研究根据GenBank上PEDVYZ毒株基因的序列设计并合成上下游引物，通过RT-PCR的方法进行PEDV相关编码蛋白基因的扩增，采用基因克隆技术分别连接至PCAGGS和PXJ41真核表达载体中，将经生物公司测序和双酶切鉴定正确的质粒转染至HEK-293T细胞中，通过Westernblot鉴定这些病毒蛋白的表达，成功构建了9个重组质粒，分别命名为PXJ41-NSP2、PXJ41-NSP3、PXJ41-NSP8、PXJ41-NSP10、PXJ41-NSP14、PCAGGS-M、PCAGGS-N、PCAGGS-S1和PCAGGS-S2。 3、诱导细胞凋亡PEDV病毒蛋白的筛选 为进一步探究PEDV哪些病毒蛋白是促细胞凋亡因子，通过构建好的PEDV相关病毒蛋白真核表达质粒，采用AnnexinV-FITC/PI，通过流式细胞术检测，结果显示转染PEDV病毒蛋白NSP3，NSP5和M蛋白重组质粒后，细胞凋亡率明显增高，提示PEDV病毒蛋白NSP3，NSP5和M蛋白能够诱导细胞凋亡。为探究PEDV病毒蛋白NSP3，NSP5和M蛋白转染不同剂量和不同时间与细胞凋亡之间的关系。通过流式细胞术检测，结果发现，转染PEDV病毒蛋白NSP3，NSP5和M蛋白重组质粒后，细胞凋亡率明显增高，且诱导细胞凋亡呈现时间和剂量依赖性。说明PEDV病毒蛋白NSP3，NSP5和M蛋白可能是促凋亡因子，本研究为进一步研究PEDV病毒蛋白与细胞凋亡的关系，探究PEDV病毒感染和宿主拮抗相互作用提供了重要基础。
NETL