摘要
非洲猪瘟（Africanswine，ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africanclassicalswinefever，ASFV）引起的一种高传染性、高致死率的猪病毒性疾病，目前没有商业疫苗可用。ASFV是双链DNA病毒，其基因组在170-193kbp范围内，编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白。病毒粒子最外在的蛋白质壳是二十面体衣壳，主要由病毒基因B646L编码蛋白p72组装而成。主要的衣壳蛋白（MajorCapsidProtein）p72是病毒体最主要的结构成分，约占病毒颗粒总重量的32%，是感染猪中检测到的主要抗原之一，且被认为是血清学诊断的重要免疫优势抗原。p12蛋白是由二硫键连接的二聚体，位于病毒的外囊膜及内囊膜上，表观分子量为17kDa，与病毒附着在宿主细胞上有关。本实验对ASFVp72蛋白进行分段截短表达，初步鉴定分析了本实验室保存的针对ASFVp72蛋白的40株鼠源单克隆抗体识别表位，确定了单克隆抗体1号识别表位为氨基酸296-TPITDA-301。构建了稳定表达非洲猪瘟病毒p12蛋白的CHO细胞系。具体研究内容如下： 1.非洲猪瘟病毒p72抗原表位的鉴定与分析 为探究40株抗p72蛋白单克隆抗体的抗原表位，本研究首先通过生物信息学方法预测分析表位后构建不同段真核表达蛋白截短体，通过间接免疫荧光和WesternBlot检测40株p72蛋白的单克隆抗体与表达的p72蛋白截短体之间的反应性，鉴定出某些单克隆抗体识别的抗原表位，分析其中aa203-238、aa296-301和aa580-612表位在23株不同的非洲猪瘟病毒毒株中的保守性，同时预测这3个抗原表位在p72蛋白上的分布。结果显示：单克隆抗体2号和4号识别的抗原表位位于氨基酸1-92之间；单克隆抗体10号识别的抗原表位位于氨基酸31-92之间；单克隆抗体17号和26号识别的抗原表位位于氨基酸203-238之间；氨基酸296-TPITDA-301是单克隆抗体1号识别的抗原表位；本研究鉴定的抗原表位都有较好的保守性，其中aa203-238和aa296-301在个别毒株中存在单个氨基酸差异，但是在我国流行毒株中呈高度保守性，aa580-612抗原表位在不同ASFV毒株中高度保守；预测aa203-238是构象B细胞表位，aa296-301和aa580-612为线性B细胞表位。ASFVp72抗原表位的鉴定与分析有助于了解p72蛋白的结构和功能，为免疫学检测方法的建立打下坚实基础，并为今后进一步研究表位疫苗的研制提供依据。 2.稳定表达非洲猪瘟病毒p12蛋白的CHO细胞系的建立和鉴定 为了建立稳定表达非洲猪瘟病毒p12蛋白的CHO细胞系，进一步研究该蛋白的功能，将非洲猪瘟病毒GZ201801（GenBank:MT496893.1）毒株的O61R基因克隆入慢病毒载体pLVX-puro-mCherry中构建重组慢病毒质粒pLVX-Puro-p12-mCherry，将该质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞来包装表达慢病毒。慢病毒感染CHO细胞后利用嘌呤霉素抗性压力筛选阳性细胞，并采用荧光显微镜和WesternBlot鉴定转染细胞中p12蛋白的表达情况，间接免疫荧光检测非洲猪瘟血清和其他猪病血清。结果表明，成功构建了重组质粒pLVX-Puro-p12-mCherry，获得1株能稳定表达p12蛋白的细胞系。间接免疫荧光结果表明，p12蛋白与微丝骨架蛋白共定位于细胞膜上，该蛋白能与非洲猪瘟血清反应，不与其他猪病阳性血清反应。本研究成功建立了稳定表达ASFVp12蛋白的CHO细胞系，为ASFVp12蛋白生物学功能研究和ASFV的临床检测奠定了基础。
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