摘要
微小RNAs（miRNAs）是一类在体内分布普遍的单链非编码RNA，广泛参与调控机体内多种生理过程。目前，已有大量的miRNAs被证实能够参与调控卵泡发育、类固醇激素合成和胚胎发育等重要的雌性生殖过程。但关于miRNAs基因多态性与家畜繁殖性状关系的研究较少。miR-23a是人卵巢颗粒细胞（hGC）凋亡的重要调节因子和猪卵母细胞发育潜能的分子标志，但其在猪卵巢颗粒细胞（pGC）凋亡中的作用和作用机制，以及与母猪繁殖性状的关系尚不清楚。本文拟以miR-23a为研究对象，分析其在pGC凋亡中的作用及其分子机制，挖掘与母猪繁殖性状关联的单核苷酸突变（SNVs），以期揭示miR-23a与母猪繁殖的关系。 全文研究结果如下： （1）miR-23a诱导pGC的凋亡 猪miR-23a前体序列长度为70nt，核苷酸序列与哺乳动物其它物种的一致性较高，成熟序列和种子序列与人、小鼠、马等物种完全一致。利用三种生物信息学软件共同预测得到111个miR-23a的潜在靶基因，KEGG和GO分析发现miR-23a的靶基因主要富集于细胞凋亡和转录调控等相关通路。细胞凋亡分析发现，在体外培养的pGC中转染mimics过表达miR-23a，能够极显著增加pGC的凋亡率（P＜0.001）；转染inhibitor敲减miR-23a，则能够显著降低pGC的凋亡率（P＜0.05）。上述结果表明，miR-23a能够诱导pGC的凋亡。 （2）miR-23a通过NORHA诱导pGC的凋亡 为阐明miR-23a促进pGC凋亡的分子机制，本文首先进行了miR-23a亚细胞定位分析，结果显示miR-23a主要富集于pGC的细胞核中。生物信息学分析发现，实验室前期鉴定的母猪繁殖性状关键候选基因-促凋亡lncRNANORHA的启动子含有miR-23a结合位点。qRT-PCR显示，转染miR-23amimics48h后pGC中NORHA表达水平显著升高（P＜0.05），而转染miR-23ainhibitor48h后NORHA表达水平显著降低（P＜0.05），但处理24h后NORHA的表达水平无显著变化（P＞0.05）。在体外培养的pGC中共转试验发现，过表达NORHA能够逆转由miR-23a敲减引起的pGC凋亡率下降，表明NORHA能够介导miR-23a诱导的pGC凋亡。 （3）miR-23a是pGC中NORHA的小激活RNA（saRNA） 荧光素酶活性分析发现，miR-23amimics仅能够极显著提高NORHA启动子区报告载体的荧光素酶活性（P＜0.01），但对miR-23a结合位点突变后的报告载体无显著影响（P＞0.05），说明miR-23a能够通过NORHA启动子区miR-23a结合位点激活NORHA转录活性。ChIP试验发现，AGO2能够在pGC中NORHA启动子区miR-23a结合位点处富集，而过表达miR-23a能够减少H3K9me2和H3K9me3在NORHA启动子区miR-23a结合位点处的富集。上述结果表明，miR-23a可作为saRNA，通过与NORHA启动子区结合，改变NORHA启动子区组蛋白修饰，诱导pGC中NORHA基因的转录。 （4）miR-23a是影响母猪繁殖性状的功能miRNA 通过缺失表达载体构建和荧光素酶活性试验发现miR-23a的核心启动子区位于-658nt~-289nt。利用混池DNA测序技术，在miR-23a核心启动子区-398nt处发现了一个C/T突变，命名为g.-398C＞T。对346头大白猪群体进行基因分型，结果发现了3种基因型，基因频率分别为0.41（CC）、0.47（CT）和0.12（TT），等位基因频率为0.65（C）和0.35（T）。利用SAS软件对g.-398C＞T位点多态性与大白猪繁殖性状进行关联分析，结果发现在经产母猪中，TT基因型大白猪的总产仔数（TNB）显著高于CC基因型大白猪（P＜0.05），两者平均每胎相差0.55头。荧光素酶活性试验发现，g.-398C＞T位点C等位型报告载体pGL3-C的荧光活性极显著高于T等位型报告载体pGL3-T（P＜0.01）。定量PCR结果表明CC基因型pGC中miR-23a的表达水平显著高于TT基因型pGC（P＜0.05）。另外，在miR-23a核心启动子区与转录起始位点之间的启动子区还发现2个SNVs，g.-283G＞C和g.-271C＞T；关联分析发现这2个SNVs的合并基因型与母猪繁殖性状显著关联；荧光素酶活性分析发现C-C单倍型启动子区活性显著高于G-C单倍型和C-T单倍型（P＜0.05）；定量分析发现转染包含C-C单倍型启动子区的miR-23a过表达载体的pGC中的miR-23a表达水平极显著高于转染包含G-C单倍型和C-T单倍型启动子区过表达载体的pGC（P＜0.01）。这些结果说明miR-23a为影响母猪繁殖性状的功能miRNA，启动子区g.-398C＞T、g.-283G＞C和g.-271C＞T突变通过影响miR-23a转录发挥作用。 （5）g.-398C＞T突变通过结合转录抑制因子SMAD4抑制miR-23a转录和功能 生物信息学预测发现g.-398C＞T突变在猪miR-23a核心启动子区创造了一个新的转录因子SMAD4的潜在结合位点，但g.-283G＞C和g.-271C＞T突变未引起生殖相关转录因子结合位点的改变。荧光素酶活性试验发现SMAD4能够显著降低T等位型启动子报告载体的荧光素酶活性（P＜0.05），而对C等位型启动子报告载体的荧光素酶没有显著影响（P＞0.05）。ChIP分析证实SMAD4仅能特异性的结合于TT基因型而不是CC基因型pGC中miR-23a的g.-398C＞T位点处，并仅显著抑制TT基因型pGC中miR-23a的表达（P＜0.05）。qRT-PCR分析表明，miR-23a的过表达能够挽救由SMAD4过表达引起的NORHA表达水平的下调；流式细胞术结果表明miR-23a的过表达能够逆转由SMAD4过表达导致的pGC凋亡率的下调。上述结果表明，g.-398C＞T突变通过结合转录抑制因子SMAD4抑制miR-23a转录及其调控NORHA表达和pGC凋亡的功能。 （6）miR-23ag.-398C＞T突变降低pGC对氧化应激的应答 实验室前期研究证实，氧化应激效应蛋白FoxO1是pGC中NORHA的下游因子。蛋白免疫印迹试验发现，过表达miR-23a能够显著上调pGC中FoxO1的表达水平（P＜0.05）。qRT-PCR试验表明，CC基因型pGC中NORHA和FoxO1的表达水平均极显著高于TT基因型pGC（P＜0.01）。利用H2O2诱导的pGC发生氧化应激，流式细胞术结果表明，CC基因型pGC的凋亡率的上升幅度显著高于TT基因型的pGC（P＜0.05）。结果表明，miR-23ag.-398C＞T突变降低了pGC对氧化应激的应答。 总之，本文证实了miR-23a是pGC中的促凋亡因子和影响母猪繁殖性状的关键miRNA；发现了miRNA与lncRNA调节关系的新模式，即细胞核miR-23a作为saRNA与lncRNANORHA启动子直接结合，促进pGC中NORHA的转录；阐明了miR-23a启动子区中SNVg.-398C＞T影响母猪繁殖性状的分子机制，为母猪繁殖性状的分子育种提供了潜在的分子标记和靶点。
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