摘要
茄二十八星瓢虫(Henosepilachnavigintioctopunctata)主要危害茄科和葫芦科作物，特别是马铃薯，已被我国列入马铃薯重大病虫害―六病四虫之一。该虫是典型的的全变态昆虫，各个虫态间的转变均受20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)信号调控。蜕皮激素受体(ecdysonereceptor，EcR)是20E激活下游基因级联信号所必需的关键因子。在虫龄数多于5个的多种幼虫（若虫）中，E93具有三重作用：决定幼虫蜕皮次数，终止幼虫形态和决定成虫形态。但其功能因虫而异，在幼虫只有3个虫龄的黑腹果蝇中，E93只保留了最后一个功能，其敲除品系能正常化蛹但成虫畸形。茄二十八星瓢虫的幼虫仅有4个虫龄，处于过渡阶段。研究E93在茄二十八星瓢虫生长发育中的重要功能，可望在昆虫E93功能进化方面提供有力证据。FTZ-F1是20E信号转导途径最下游的转录因子，靶向昆虫的蜕皮，但其亚型的特异性功能在非果蝇昆虫中是一个研究空白。 此外，RNAi应用于害虫防治，摄食dsRNA是可操作的治理方法之一。在植株叶片上喷施dsRNA可望应用于茄二十八星瓢虫的特效绿色防控。 本文拟明晰生长和变态过程中20E调控网络的关键节点基因的功能，评估叶面喷施dsHvEcR对幼虫的致死效果，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。现将研究结果总结如下。 1.干扰HvEcR损害了幼虫化蛹 挖掘茄二十八星瓢虫转录组数据，鉴定了茄二十八星瓢虫HvEcR的2个亚型，分别命名为HvEcR-A和HvEcR-B1。其中HvEcR-A的ORF全长1491bp，编码496个氨基酸；HvEcR-B1的ORF全长1713bp，编码570个氨基酸。HvEcR具有典型的核受体保守结构域，包括DNA结合域(C域)和配体结合域(E域)。HvEcR在茄二十八星瓢虫的整个发育时期和幼虫不同组织中均表达，在幼虫期表达量最高，蛹期次之，这预示着其在幼虫生长发育和变态过程中的重要性。 在实验室生物测定中，dsHvEcR设计在两个亚型的公共区域。应用大肠杆菌表达的dsHvEcR浸叶饲喂和注射体外合成的dsHvEcR两种方法，干扰结果相似。浸叶法连续3天饲喂4龄幼虫，靶标基因被干扰了57%。85%的试虫死于预蛹期或形成异常蛹，并且羽化失败。其余15%的试虫正常化蛹，但均在羽化后一周内死亡。相同条件处理3龄幼虫，靶标基因被干扰了65%。所有干扰幼虫均发育受阻，停滞在预蛹期，最终死亡。注射法同样成功干扰了靶标基因，3龄和4龄的干扰效率分别为75%和80%，并且均造成所有干扰幼虫化蛹失败。定量检测发现，干扰HvEcR显著降低了20E信号途径基因HvE93、HvE74、HvE75和HvHR3的表达水平，阻断了20E信号转导。在温室实验中，将表达了dsHvEcR的大肠杆菌菌液喷施在马铃薯植株叶片上，接种的3龄和4龄幼虫取食后造成了更显著的杀虫效果。100%干扰幼虫均在预蛹期停止发育，黑化干瘪死亡，化蛹失败。而且，喷施dsHvEcR后显著减少了幼虫取食，降低了马铃薯叶片的被害程度。 因此，在植株叶片上喷施dsHvEcR可望应用于茄二十八星瓢虫的特效绿色防控。 2.敲低HvE93影响了幼虫化蛹及成虫羽化 鉴定了茄二十八星瓢虫HvE93的2个亚型，分别命名为HvE93X1和HvE93X2。HvE93X1的ORF全长2976bp，编码991个氨基酸；HvE93X2的ORF全长2988bp，编码995个氨基酸。HvE93蛋白具有两个典型的psq-typeHTH结构域。HvE93X1和HvE93X2具有相似的时空表达模式。在茄二十八星瓢虫的整个生育期内，它们均在蛹期和成虫期高水平表达，预蛹期次之。在4龄幼虫中，两者都前肠和中肠高水平表达。 显微注射dsHvKr-h1或dsHvHairy抑制3龄幼虫期的JH信号途径，HvE93的表达增加，但不导致提前变态。在3龄注射包含两个亚型公共区域的dsHvE93，显著抑制了两个转录本的表达。干扰了HvE93的幼虫正常发育且在4龄末期及时启动变态。这表明茄二十八星瓢虫幼虫的四个虫龄在进化过程中固定，不受激素信号影响。 在4龄干扰HvE93后，幼虫体内20E和JH信号紊乱。HvKr-h1基因的表达量增加。相反，5个Halloween基因的表达量减少，20E的生物合成受到抑制。此外，20E信号途径下游基因HvEcRA、HvEcRB1、HvUSP、HvE74和HvFtz-f1的表达显著降低，而HvBrC、HvE75、HvHR3和HvHR4的表达显著增加。 在3龄、4龄和预蛹期敲低HvE93的mRNA导致幼虫-蛹的复合体表型：蛹的刚毛和幼虫枝刺同时存在于处理蛹的表皮上。在3龄、4龄、预蛹期和蛹期干扰HvE93阻止了蛹的发育。只有少数蛹能羽化为畸形成虫；这些成虫鞘翅分离，后翅折叠异常，触角和足等附肢较小。这表明在茄二十八星瓢虫的蛹期，高水平的HvE93对其幼虫结构的终止和成虫结构的分化是必需的。 综上所述，HvE93在茄二十八星瓢虫中具有双重功能：终止幼虫形态和决定成虫形态。与具有三重功能的赤拟谷盗、德国小蠊和一种功能的黑腹果蝇不同，两重功能的茄二十八星瓢虫属于中间过渡类型。因此，本章结果提供了进化过程中缺失的一环，明晰了E93功能的简化过程，即三重作用，二重作用和一重作用。 3.HvFTZ-F1亚型特异性调控幼虫-幼虫及幼虫-蛹蜕皮的分子机理 基于Brunet提出的假说：蜕皮类动物(线虫除外)的FTZ-F1编码两种转录本，生成具有独特N端部分的异构体。我们分析比对了双翅目、鞘翅目、鳞翅目和膜翅目中具有代表性的昆虫FTZ-F1的基因结构，证实了昆虫HvFTZ-F1基因亦编码两个剪接亚体，其中βFTZ-F1的转录起源于编码DBD结构域的αFTZ-F1外显子上游的一个内含子。按照此规则，将茄二十八星瓢虫中鉴定到的HvFTZ-F1的两个亚型并分别命名为HvαFTZ-F1和HvβFTZ-F1。其中HvαFTZ-F1的ORF全长1713bp，编码570个氨基酸；HvβFTZ-F1的ORF全长1827bp，编码608个氨基酸。HvFTZ-F1具有典型的核受体保守结构域。HvαFTZ-F1和HvβFTZ-F1在卵至成虫的整个发育期和4龄组织中广泛表达。其中HvαFTZ-F1在卵期表达量最高，而HvβFTZ-F1在1龄和2龄蜕皮前以及预蛹期和蛹期高水平表达。两者均在4龄幼虫表皮细胞和肠道高水平表达，而在马氏管和脂肪体低水平表达。 测定了RNA干扰同时抑制两个亚型、单独抑制HvαFTZ-F1或HvβFTZ-F1对幼虫发育的影响，发现干扰4龄幼虫两个亚型，100%的试虫在预蛹期发育停滞，不能正常活动并逐渐黑化死亡。分别干扰HvαFTZ-F1或HvβFTZ-F1时，其dsRNA显著抑制了相应亚型的表达，而对另一亚型无影响。HvβFTZ-F1被干扰的4龄幼虫约95%发育停滞，在预蛹期死亡。剩余5%试虫则形成畸形蛹，它们被蜕部分包裹，全部不能羽化。相反，干扰HvαFTZ-F1不影响幼虫发育。 在3龄幼虫中同时RNA干扰两个亚型、或单独干扰HvαFTZ-F1或HvβFTZ-F1，定量分析结果表明，干扰两个亚型时对应的mRNA含量显著下降；干扰HvαFTZ-F1后，HvβFTZ-F1表达量显著增加，干扰HvβFTZ-F1却对HvαFTZ-F1的表达无明显影响。两个亚型被干扰后，全部试虫在3龄末期停止发育，不能蜕皮至4龄，但新表皮已经形成。在延长的3龄期，处理试虫消耗了大量营养物质，脂肪体减少，甘油三酯含量显著下降，虫体弯曲呈半月状。干扰3龄幼虫HvβFTZ-F1，所有试虫均能蜕皮，但在4龄时停止发育，不能化蛹。相反，干扰HvαFTZ-F1对幼虫-幼虫蜕皮及幼虫-蛹变态无明显影响。 因此，HvαFTZ-F1和HvβFTZ-F1在幼虫-幼虫蜕皮过程中起着必不可少的作用，而HvβFTZ-F1对于幼虫-蛹转化是必要且充分的。
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