摘要
肉类能够为人体提供优质的蛋白质及丰富的营养素，是人们膳食结构的重要组成部分。肌原纤维蛋白（Myofibrillarprotein,MP）是肌肉中含量最高、最重要的蛋白质，其功能特性直接影响了肉及肉制品的最终品质。在凝胶乳化类肉制品的加工中常需要加入各种添加物，以增强产品的品质及消费者的接受度。近些年来，为了改善凝胶乳化类肉制品的加工特性及感官品质，国内外研究学者就碳水化合物、多酚、转谷氨酰胺酶、非肉蛋白质等各种添加物与MP之间的相互作用进行了广泛深入的研究。其中多糖、多酚作为两类重要的生物分子，其与MP的非共价与共价作用修饰作用机制已得到了充分阐明。但是目前国内外对于多糖及多酚协同共价修饰MP的分子机理及对MP功能特性的影响规律还未得到揭示。基于此，本研究的目的是首先制备MP-多糖-多酚三元共价复合物，探究多糖、多酚协同共价修饰MP的分子机制，进一步解析多糖、多酚协同共价修饰对MP分子构象的影响规律，并揭示多糖、多酚协同共价修饰改善MP功能特性的作用机制。在此基础上，进一步系统阐明MP-多糖-多酚三元共价复合物稳定含有不饱和脂肪酸乳液的机理。研究结果可为多糖、多酚协同修饰蛋白质功能特性奠定坚实的理论基础，并能够为扩大肌肉蛋白在食品工业中利用范围提供参考。具体研究内容和结果如下： 1.肌原纤维蛋白-葡聚糖共价复合物的制备及其性质表征 为了探究采用温和加热的湿法糖化反应实现葡聚糖（Dextran，DX）与MP共价结合的可行性，本研究将MP与不同分子量的DX（20kDa、40kDa和70kDa）在37℃的反应温度下反应8h，利用紫外-可见分光光度法、SDS-PAGE电泳及三硝基苯磺酸(TNBS)方法证明了不同分子量的DX与MP的共价结合；并以未处理的MP及在37℃下单纯加热的MP作为对照组，研究了DX共价修饰对MP浊度、粒径分布、流变特性及微观形态的影响。反应样品溶液的紫外吸收值及SDS-PAGE电泳条带结果表明不同分子量的DX与MP在实验条件下发生了糖化反应，并生成了无色中间产物。研究结果表明：随着DX分子量的增加，糖化反应的接枝度显著增加（P＜0.05），当DX分子量为70kDa时，其与MP共价反应所得接枝度为8.8%。糖化反应修饰后MP溶液的浊度及流动性显著增加（P＜0.05），蛋白质分子之间的相互作用受到抑制。此外，随着DX分子量的增加，糖化MP的粒径显著降低（P＜0.05），MP分子在溶液中的分布更加均匀。因此，上述结果表明采用温和加热的湿法糖化反应能够制备MP-DX共价复合物，并且糖化反应对MP性质的调控受DX分子量的影响，当DX分子量为70kDa时，接枝度最高。 2.葡聚糖共价修饰改善肌原纤维蛋白功能特性的作用机制 在上述研究结果的基础上，为了阐明不同分子量的DX共价修饰改善MP功能特性的分子机制，主要解析了经糖化反应修饰后MP二级结构及三级结构的变化规律，并深入研究了三个不同分子量的DX共价修饰对MP溶解度与乳化特性的影响。研究结果显示：DX的共价修饰对MP的分子构象产生了显著的影响。糖化反应后MP分子结构中α-螺旋的含量显著降低（P＜0.05），芳香族氨基酸侧链基团得以暴露至蛋白分子表面。且随着DX分子量的增加，糖化MP的表面疏水性与Ca2+-ATP酶活性显著降低（P＜0.05）。对糖化MP的功能特性（溶解度与乳化特性）的研究结果分析后可知，与未处理的MP及在37℃下单纯加热的MP相比，随着DX分子量的增加，糖化MP的乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）显著增加（P＜0.05），其在等电点（pH5.5）与反应条件（pH7.5）处的溶解度均显著增加（P＜0.05），其中当DX分子量为70kDa时，糖化MP在pH7.5条件下的溶解度达88.5%。综上所述，DX的共价连接增加了MP分子表面的亲水性，导致MP分子构象展开，并由于共价结合的DX分子产生的空间位阻效应，改善了MP在溶液中的分散性及稳定性，并最终改善了MP的溶解度与乳化特性。 3.多酚共价对糖化肌原纤维蛋白热稳定性与抗氧化特性的影响研究 为了进一步明确多酚共价对糖化MP（MP-DX共价复合物）热稳定性与抗氧化特性的影响规律，选用没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechingallate,EGCG）、儿茶素（Catechin,C）与没食子酸（Gallicacid，GA）三种酚类化合物，采用自由基接枝方法制备了MP-DX-多酚三元共价复合物。以未处理MP与糖化MP作为对照组，测定了MP-DX-多酚三元共价复合物侧链氨基酸基团、二级结构与三级结构等分子构象的变化情况，建立了MP-DX-多酚三元共价复合物分子构象与热稳定性、抗氧化特性之间的内在关联。研究结果表明：在制备的三个三元共价复合物中，EGCG、C与GA三种多酚的含量分别为58.02μmol/g、44.63μmol/g与21.97μmol/g。通过与未处理MP与糖化MP相比较，发现糖化MP中自由氨基、巯基及酪氨酸基团参与了与三种多酚的共价接枝反应。EGCG、C与GA三种多酚的共价结合导致糖化MP发生了进一步地解折叠作用，疏水性氨基酸基团暴露质蛋白分子表面。EGCG、C与GA三种多酚的共价结合抑制了肌球蛋白分子头部的展开及交联作用，显著提高（P＜0.05）了糖化MP的热稳定性与变性温度。此外，随着多酚分子结构中酚羟基含量的增加，MP-DX-多酚三元共价复合物的自由基清除能力显著提高（P＜0.05），MP-DX-EGCG三元共价复合物的抗氧化特性最强。总的来说，EGCG、C与GA三种多酚的共价增强了MP-DX复合物的热稳定性与抗氧化特性。 4.肌原纤维蛋白-葡聚糖-多酚共价复合物稳定的亚麻籽油乳液的制备及其特性研究 为了评估MP-DX-多酚三元共价复合物稳定含有不饱和脂肪酸的乳液体系的效果，本章主要首先制备了由未处理MP、糖化MP及MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液体系，并比较了未处理MP、糖化MP及MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液的粒径、流变特性、流动特性及体外模拟消化特性的变化情况。研究结果表明：与未处理MP稳定的乳液相比，DX与多酚的共价结合显著降低了（P＜0.05）MP稳定的乳液体系的粒径，并且MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液的粒径最小。通过乳液的粘度曲线分析结果可知MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的乳液表观粘度最大，并且随着多酚分子量的增加，乳液的表观粘度不断增大。1H高场核磁共振测定分析结果也证明了与未处理MP、糖化MP相比，MP-DX-多酚共价复合物稳定的乳液中蛋白分子与油分子的相互作用增强，乳液体系中水分子的流动性降低。经过体外模拟胃消化过程后，与未处理MP稳定的乳液相比，糖化MP、MP-DX-多酚共价复合物稳定的乳液在胃肠消化阶段的粒径值显著降低（P＜0.05）；此外，在体外模拟肠道消化阶段，MP-DX-EGCG三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液中游离脂肪酸释放速率最低，表明DX与多酚的共价结合能够增强MP稳定的不饱和脂肪酸乳液体系的在体外模拟胃肠消化过程中的稳定性。 5.肌原纤维蛋白-葡聚糖-多酚共价复合物稳定亚麻籽油乳液的机理研究 在上述研究结果的基础上，为了揭示MP-DX-多酚共价复合物稳定亚麻籽油乳液的机理，本章节解析了MP-DX-多酚三元共价复合物在油/水界面上蛋白质浓度及含量、蛋白分子构象的变化规律。结果显示：与未处理的MP稳定的乳液相比，DX与多酚的共价连接能够显著降低（P＜0.05）亚麻籽油乳液在存储期间的乳析现象。此外，MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液在存储7天后脂质氢过氧化物（脂肪氧化初级产物）、TBARS（脂肪氧化次级产物）及羰基含量均显著低于（P＜0.05）未处理的MP及糖化MP稳定的乳液；进一步通过测定乳液体系在存储一周后蛋白巯基含量的变化发现，随着乳液存储时间的增加，所有乳液中蛋白巯基的含量均显著增加（P＜0.05），当存储时间达7天时，MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液中蛋白的巯基含量高于其他乳液体系中的蛋白巯基含量。通过测定界面蛋白质含量与浓度发现，MP-DX-多酚三元共价复合物在油/水界面上的蛋白含量及浓度显著增加（P＜0.05），其中MP-DX-EGCG三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液的界面蛋白浓度最高，达9.52mg/m2；此外，进一步通过分析界面蛋白的分子构象变化发现，多酚的共价接枝促进了糖化MP在油/水界面上的进一步展开与重排，并导致蛋白分子在油/水界面上形成更加稳定的界面蛋白膜。总体而言，MP-DX-多酚共价复合物改善了亚麻籽油乳液的物理与化学稳定性。 综上所述：采用温和加热的湿法糖化反应与自由基接枝方法制备了MP-DX-多酚三元共价复合物。DX与多酚的共价结合提高了MP的功能特性，MP-DX-多酚三元共价复合物的结构与功能特性受DX与多酚分子量及种类的影响。此外，MP-DX-多酚三元共价复合物稳定的亚麻籽油乳液表现出优异的物理化学稳定性，这为建立以MP-DX-多酚三元共价复合物为基质的包埋健康多不饱和脂肪酸的递送体系奠定了理论基础，并为肌肉蛋白在食品工业中的进一步应用提供了新的研究方向。
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