摘要
鸡肺作为家禽屠宰过程的副产物，目前主要作为低价饲料或被直接处理后作为废弃物，造成了资源浪费和环境污染。我国每年屠宰上百亿只肉鸡，获得的鸡肺重量达到十几万吨，如果能得到合理的高值化应用，会带来巨大的经济效益。目前，酶解畜禽屠宰副产物制备生物活性肽已走入人们的视野，成为副产物应用的新趋势。 食品在生产、储藏和运输过程中会发生脂肪和蛋白氧化，引起产品外观形态、食用品质的劣变。同时自由基和活性氧会引起人体细胞发生氧化应激，加速细胞衰老，引起一系列的疾病。近年来，由于合成抗氧化剂的安全性问题，安全性高、家禽屠宰副产物来源的具有抗氧化功能的生物活性肽逐渐走入人们的视野，开始应用于食品中。许多研究表明，生物活性肽对于外界环境变化有一定的敏感度，酸碱性环境、食品配料、金属离子等都会对其活性产生一定影响，因此需要寻找一种安全有效、成本合理的方式来改善其活性。 本研究通过单因素和响应曲面试验优化了酶解生产鸡肺抗氧化肽的工艺。并采用超滤手段对其进行初步分离纯化，测定纯化后样品的肽分子量分布和序列。采用多种自由基指标评价鸡肺抗氧化肽的环境稳定性和耐消化性。利用外源氨基酸修饰的类蛋白反应提升鸡肺抗氧化肽的抗氧化活性与热稳定性，观察蛋白质二级和三级结构的变化来分析反应涉及的机理。具体研究内容和结果如下： 1．酶法制备鸡肺抗氧化肽及其序列分析 本章测定了鸡肺的基本化学成分，并通过酶解的方式制备了抗氧化肽。首先以1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率和肽含量为指标，利用单因素实验探索了酶的种类、pH、酶添加量、酶解时间对鸡肺抗氧化肽活性的影响。在此基础上，通过Box-Behnken响应曲面试验优化了胃蛋白酶酶解制备鸡肺抗氧化肽的最优反应条件，得到主要影响因素为pH、酶添加量、酶解时间，拟合出最优酶解条件为pH3.60，酶添加量4200U/g，酶解时间5h，验证试验的DPPH·清除率和粗肽含量分别为94.96%和88.42%。与未经酶解的鸡肺匀浆上清液相比，酶解得到的粗肽液游离氨基酸含量显著升高(P＜0.05)。超滤产物中＜3kDa组分抗氧化能力最强，该组分分子量＜1000Da的比例为86.70%，液质联用测序发现疏水残基比≥50%的肽段高达60.97%，Val和Leu占肽链N端出现频率的48.78%。 2．鸡肺抗氧化肤稳定性与体外模拟消化研究 以DPPH·清除率、FRAP铁还原力、ABTS+·清除率为指标，探索温度、pH、食品原料、金属离子、食品防腐剂及体外模拟胃肠道消化对鸡肺抗氧化肽活性的影响。结果显示，高温和酸碱条件下，鸡肺抗氧化肽的自由基清除率和铁还原力显著下降(P＜0.05)。较低浓度的NaCl和葡萄糖有利于提升抗氧化活性，柠檬酸对于铁还原力和ABTS+·的影响相反。K+和Cu2+的加入都会导致鸡肺抗氧化肽活性显著下降。体外模拟消化后鸡肺抗氧化肽的分子量逐步减小，游离氨基酸含量显著增加，表面疏水性先上升后下降。鸡肺肽在肠消化过程的ABTS+·清除率上升幅度明显高于胃消化阶段。 3.外源氨基酸修饰的类蛋白反应对鸡肺抗氧化肽结构与功能的影响 天然生物活性肽往往功能特性和热稳定性差，为改善生物活性肽的抗氧化能力和热稳定性，采用胃蛋白酶和外源氨基酸参与的类蛋白反应对鸡肺抗氧化肽进行处理。利用高效液相色谱测定反应前后的分子量变化，采用紫外光谱、荧光光谱、X射线衍射图谱、扫描电镜对类蛋白反应前后物质的性质进行表征，通过傅里叶变换红外光谱、圆二色光谱探索蛋白质二级和三级结构的变化。结果表明，3%添加量的半胱氨酸处理后其DPPH?清除率、Fe2+螯合能力和?OH清除率分别提升了51.85%、31.11%、31.30%，热变性温度从122.06℃提升至136.15℃。类蛋白反应使产物的分子量和表面疏水性增大，紫外和荧光光谱表明氨基酸微环境的变化改善了抗氧化活性。X射线衍射图谱显示类蛋白反应发生后样品主衍射峰变宽、强度降低，扫描电镜结果表明反应涉及到分子的水解与再聚合。红外光谱和圆二色光谱结果显示多肽分子舒展、疏水基团暴露，这可能是多肽抗氧化能力改善的原因。 综上，本研究制备了具有良好抗氧化能力的鸡肺活性肽，研究了其环境稳定性，并利用类蛋白反应改善了其抗氧化性和热稳定性。本研究将为畜禽屠宰副产物来源的多肽制备与改性提供参考。
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