摘要
平菇（Pleurotusspp.）因易于栽培、生物学效率高、兼具食用和药用价值而在世界范围内被广泛栽培和消费。菌盖颜色是平菇重要的农艺性状，是影响消费者购买意愿的重要因素，因此该性状成为平菇育种的重要目标。然而，平菇菌盖颜色的形成机制尚未被解析，限制了平菇颜色性状改良的分子育种进程。本论文选取具有代表性颜色性状的平菇种类，即白黄侧耳（Pleurotuscornucopiae）、桃红侧耳（Pleurotusdjamor）、金顶侧耳（Pleurotuscitrinopileatus）为研究材料，解析菌盖颜色形成的化学基础和分子调控机制。主要结果如下： 1.成功对平菇色素进行提取和化学成分分析。以菌盖颜色为灰黑色（白黄侧耳）、黄色（金顶侧耳）和粉红色（桃红侧耳）的平菇菌株为研究材料，利用碱溶酸沉的方法成功提取其色素。三种平菇色素的颜色分别呈现黑色、黄褐色、红棕色，与其菌盖颜色基本相一致。溶解性及化学反应实验结果表明：三种平菇色素的溶解性和化学反应特征与黑色素特征一致。紫外-可见光全波长扫描、红外光谱、核磁共振光谱分析结果表明：三种平菇色素的吸收峰与黑色素特征吸收峰一致，主要含有酚羟基、羧基、氨基、羰基、亚甲基和甲基等官能团。上述结果表明三种平菇色素均为黑色素。HPLC和元素分析结果表明，三种平菇黑色素均为真黑色素和棕黑色素的混合物，但两者的数量和相对比例不同使平菇菌盖呈现灰黑色、黄色、粉红色不同颜色。灰黑色平菇中真黑色素含量最高，而黄色和粉红色平菇中棕黑色素比例高，且粉红色平菇中棕黑色素比例最高。另外，利用透射电镜观察到：有色平菇菌盖表皮组织的细胞壁比白色平菇的更厚，电子密度更高，表明平菇黑色素可能在细胞壁中积累。 2.完成平菇菌盖颜色性状的精细定位及候选基因PcTYR功能分析。以白黄侧耳黑色单核菌株BPC067和白色单核菌株358P1为亲本菌株，构建了同时分离黑色和白色等位基因的子代群体。选择群体中极端颜色性状的子代个体进行BSA-seq（bulked-segregantanalysissequencing）和XP-GWAS（extreme-phenotypegenome-wideassociationstudies）联合分析，对菌盖颜色性状进行精细定位，在7号染色体上定位到一个0.8Mb的主效QTL（quantitativetraitloci）区域。选取具有极端颜色性状的菌株进行转录组分析，筛选到四个重要的差异表达基因。结合精细定位和转录组分析结果，确定一个酪氨酸酶基因（PcTYR）为重要的候选基因。qPCR分析表明PcTYR基因的表达水平与菌盖颜色WI值显著相关（r=-0.727,p＜0.01）。利用基因过表达和RNA干扰技术对该基因进行功能验证，结果显示过表达PcTYR基因使菌盖颜色明显变深，而PcTYR基因RNA干扰菌株的菌盖颜色呈浅棕色，较野生型菌株明显变浅，说明PcTYR是控制平菇菌盖颜色形成的关键基因。对PcTYR启动子和基因区域进行序列多态性分析，鉴定到4个与菌盖颜色性状共分离的SNPs，单核苷酸位点的突变可能影响了PcTYR基因的表达水平。 3.初步阐明高温条件下平菇菌盖颜色变浅的分子机制。与常温（18℃）相比，高温（26℃）下白黄侧耳菌盖颜色明显变浅，幼菇期菌盖颜色差异更显著。高温导致平菇菌盖颜色形成关键基因PcTYR的表达水平显著下降28.73%，TYR酶活力显著下降47.62%，说明PcTYR基因表达水平下调，进而引起酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）酶活力下降是高温导致菌盖颜色变浅的重要原因。为进一步探究PcTYR基因响应高温条件的分子调控途径，以18℃和26℃处理下的幼菇期菌盖表皮为样品进行比较转录组学分析。共筛选到199个差异表达基因，GO和KEGG功能富集分析显示差异表达基因主要富集在细胞代谢、细胞膜组分、细胞信号转导及氨基酸、糖类、脂类合成代谢等通路。其中，高温显著影响了呼吸链电子传递途径及细胞氧化还原稳态，暗示高温诱导ROS水平升高；同时高温下内质网蛋白质加工通路显著上调，暗示高温诱导内质网应激。由此推测高温可能通过促进ROS水平升高、诱导内质网应激调控PcTYR基因，导致菌盖颜色变浅。首先，对菌盖表皮中H2O2含量进行测定，发现高温下H2O2含量显著上调了9.6倍，证明高温诱导ROS积累；18℃条件下外源添加H2O2可显著降低PcTYR基因的表达水平和TYR酶活力，而26℃条件下添加ROS清除剂（DMTU）可缓解两者的下降趋势。这些结果表明高温通过诱导ROS积累抑制PcTYR基因的表达水平，导致TYR酶活力下降，引起菌盖颜色变浅。其次，高温下内质网应激的标志性基因BiP、PDI、CNX分别显著上调了8.2倍、3.93倍和1.53倍，表明高温诱导了内质网应激。H2O2和DMTU外源添加实验进一步证明高温通过ROS诱导内质网应激。外源添加衣霉素模拟内质网应激可导致菌盖颜色明显变浅，而过表达BiP基因可缓解高温造成菌盖颜色变浅的程度，证明内质网应激负调控菌盖颜色形成。qPCR和酶活力测定实验进一步表明内质网应激不影响PcTYR基因的表达水平，而是通过降低TYR酶活力导致菌盖颜色变浅。上述结果表明，高温通过促进ROS积累下调PcTYR基因的表达水平，进而降低TYR酶活力；同时，高温通过ROS诱导内质网应激，降低TYR酶活力，最终导致菌盖颜色变浅。 本研究首次对平菇色素进行了提取和化学成分分析，对控制菌盖颜色的关键基因进行精细定位及功能研究，并初步探究了高温条件下菌盖颜色变浅的分子机制，这将为平菇颜色性状的分子育种奠定理论基础。
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