摘要
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)因其具有宿主安全性、蛋白分泌能力强、遗传操作简便、易于发酵培养等优点，现已被广泛用作重组蛋白表达宿主。但是作为表达宿主，枯草芽孢杆菌仍然存在一些不可忽视的缺点，比如天然的内源枯草芽孢杆菌启动子(如P43启动子)活性较低、表达外源基因的稳定性较差，这一缺陷严重制约了枯草芽孢杆菌在高效表达异源蛋白领域的应用。为了克服这一问题，一方面，对野生型枯草芽孢杆菌进行筛选和改造，另一方面，对表达系统中启动子元件进行优化。枯草芽孢杆菌中常用的诱导型启动子有Pylb、PxylA等，然而纯天然的诱导型启动子存在蛋白表达不稳定、与其他表达调控元件兼容性不强等问题，很多时候不能满足生产要求。鉴于此，本文旨在：第一，筛选出一株性状优良的野生枯草芽孢杆菌作为表达宿主，扩大枯草芽孢杆菌作为工业生产的菌株资源；第二，对枯草芽孢杆菌中常用的诱导型启动子进行合理优化，在保证低本底泄露的同时提高诱导表达强度，对突破天然启动子活性瓶颈、提升启动子元件稳定性和兼容性方面有巨大的应用前景，以及在扩展枯草芽孢杆菌的工业化应用方面也具有重大意义。 主要研究内容和结果归纳如下： 1、野生型枯草芽孢杆菌表达宿主的筛选 本研究以枯草芽孢杆菌中保守序列基因comK、spo0A、gyrA作为筛选依据，成功从发酵豆豉样品中分离得到12株枯草芽孢杆菌，依据生长曲线分析菌株生长特性，发现菌株KC1生长趋势明显具有优势。随后测试其抗生素敏感性，发现菌株KC1对对大部分抗生素都具有敏感性。并利用双亲接合的方式成功将其制备为感受态细胞。 2、枯草芽孢杆菌中诱导型启动子的改造 本研究以sfGFP作为报告基因，对木糖诱导型启动子PxylA以及IPTG诱导型启动子进行Phyper-spank优化改造。在实验室前人改造后的启动子PxylAly的基础上，本研究首先利用定点随机突变的方法，对启动子PxylA的R-binding区域进行改造，得到启动子PxylA13。随后在其基础上额外添加一个R-binding区域，得到启动子PxylA13+R，与启动子PxylAly相比，PxylA13+R蛋白的本底泄露仅有其3%，但诱导表达量依旧保持较高的水平，是野生型启动子的35倍。考虑到糖诱导型启动子存在一些缺点，例如通过宿主菌的碳代谢调节启动子以及宿主菌利用诱导剂作为碳源，本研究还对IPTG诱导型启动子Phyper-spank进行了改造，主要对其-35区及-10区进行优化，并在启动子下游添加mRNA稳定子STAB-SD，得到启动子Pspank3的诱导表达量比原始启动子高出5倍，但是本底泄露提高了约20倍，关于降低本底泄露的问题，需要后续进一步研究。 3、菌株KC1表达系统的应用 利用无痕敲除的方法，将枯草芽孢杆菌基因组中的两个主要胞外蛋白酶基因nprE、aprE进行基因敲除，结果显示敲除成功后的菌株KC1b胞外蛋白酶活性明显降低。随后在宿主KC1b中表达异源蛋白AmykG，结果显示淀粉酶AmykG可成功在宿主KC1b中表达，并且酶活比实验室常用宿主PD8菌株高出约25%。接着在宿主KC1b中成功表达贻贝粘蛋白Pvfp5，发现大部分目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。为提高蛋白的可溶性表达，本研究成功敲除伴侣蛋白GroESL的负调控基因hrcA，构建菌株KC1c，并成功提高了蛋白的可溶性表达。 综上所述，本研究首先利用枯草芽孢杆菌中的保守基因筛选出12株野生型枯草芽孢杆菌，随后根据生长状态选出最佳表达宿主KC1。然后对表达元件诱导型启动子进行改造，在提高表达量的同时，尽可能降低了启动子的本底泄露。最后对宿主KC1进行改造，成功表达了异源蛋白AmykG与Pvfp5。
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