摘要
植物小RNAs在调控水稻免疫，生长发育和激素信号通路上扮演着重要角色。稻瘟病作为水稻上的主要病害，对水稻产量造成严重威胁。目前研究报道众多小RNA在水稻和稻瘟菌(Magnaportheoryzae)互作系统中发挥重要作用。小RNA必须与Argonaute蛋白（OsAGO）结合形成沉默复合体才能调节靶标基因的表达，进而调节植物免疫反应。前期研究发现在水稻19个AGO蛋白中，OsAGO2能够调节水稻对稻瘟病的抗性，但是其在水稻调控稻瘟病抗性中的机制尚不清楚。本研究分别从OsAGO2蛋白上游甲基化修饰和下游沉默抗病相关基因表达两个方面探索OsAGO2对稻瘟病的抗性调控机制。向上探索OsPRMT5通过甲基化修饰对OsAGO2蛋白稳定性的调控，向下解析OsAGO2通过miR1875和miR172a分别沉默OsHXK1和OsAPX1基因表达，调控稻瘟病抗性的机制。具体研究内容如下： 一、OsPRMT5介导的OsAGO2甲基化影响水稻对稻瘟病抗性机制研究蛋白翻译后修饰在植物免疫和生长发育中发挥着重要作用。本研究通过富集OsAGO2蛋白，利用质谱分析鉴定与OsAGO2互作的蛋白，从这些鉴定的蛋白中，我们筛选验证出OsPRMT5与其互作。OsPRMT5编码精氨酸甲基转移酶，其能够催化底物发生甲基化。本研究通过质谱分析发现OsAGO2蛋白的GAR区域精氨酸能够发生甲基化，同时通过实验证明了该结果。此外本研究发现OsPRMT5能够促进OsAGO2蛋白通过26s蛋白酶体途径降解影响OsAGO2蛋白稳定性，当将OsAGO2蛋白的GAR区域精氨酸突变成丙氨酸后，发现OsPRMT5没有促进突变的OsAGO2蛋白降解，表明OsPRMT5促进OsAGO2蛋白降解依赖于OsAGO2蛋白甲基化。致病性分析发现过表达OsPRMT5植物能够增加水稻对稻瘟病的抗性，沉默植物则更加感病，同时OsPRMT5能够促进防卫基因OsPR1a的表达，表明OsPRMT5正调控水稻对稻瘟病的抗性。综合以上结果，表明OsPRMT5通过介导OsAGO2甲基化影响蛋白稳定性，进而通过OsAGO2调控水稻对稻瘟病的抗性。此外我们也发现OsAGO2能够影响种子粒长，千粒重等农艺性状。 二、OsAGO2结合miR1875抑制OsHXK1表达调控水稻对稻瘟病的抗性前文从OsAGO2上游探讨了其调控稻瘟病机制。本章内容从OsAGO2下游出发探讨其抗病机制。本研究通过富集OsAGO2蛋白，提取与OsAGO2蛋白结合的RNA进行sRNA建库，而后利用高通量测序鉴定与OsAGO2结合的小RNA，通过后期实验筛选，发现OsAGO2能够结合miR1875，miR390以及miR1436。miR1875的潜在靶标为己糖激酶OsHXK1，本研究证实了miR1875和OsHXK1之间存在着靶标关系，并且miR1875通过结合OsAGO2调控OsHXK1基因表达。研究发现ago2突变体中ROS积累量在稻瘟菌侵染位点处显著增多，增加了对稻瘟病的抗性。相应的本研究发现OsHXK1过表达植物在稻瘟菌侵染位点处ROS积累明显增多，对稻瘟病的抗性增强。过表达OsAGO2和沉默OsHXK1植物中侵染位点处ROS积累量与野生型相比没有变化，对稻瘟病的抗性减弱。研究结果表明，OsAGO2通过结合miR1875调控OsHXK1基因表达，影响了ROS积累，从而调节对稻瘟病的抗性。 三、OsAGO2介导OsAPX1表达调控水稻对稻瘟病的抗性miR172a通过OsAGO2蛋白抑制其靶标基因OsIDS1的表达，释放了受OsIDS1抑制表达的OsAPX1基因，从而提高水稻抗盐胁迫能力。同时miR172a能够响应稻瘟菌的侵染，在稻瘟菌侵染下，OsIDS1和OsAPX1呈现负相关关系，表明miR172a通过OsAPX1调节水稻对稻瘟病的抗性。OsAPX1编码抗坏血酸过氧化物酶，其具有清除过氧化氢的功能，在水稻响应非生物胁迫中清除多余的过氧化氢使植物免受氧化伤害，但是OsAPX1在生物胁迫中的作用机制并不清楚。本研究发现，OsAPX1过表达植物能够增强水稻对稻瘟病的抗性。OsAPX1调节RBOH基因的表达调控ROS含量的变化，同时激活SA信号通路。而沉默植物中则明显减弱了水稻对稻瘟病的抗性，同时防卫反应被削弱。此外我们发现OsAPX1能够影响水稻株高，种子粒长和千粒重等农艺性状。综合以上结果，表明OsAPX1激活SA信号通路正调控水稻对稻瘟病的抗性。 综上所述，本研究围绕OsAGO2蛋白探索了其参与调控稻瘟病的抗性机制，向上探讨了OsPRMT5通过调控OsAGO2蛋白稳定性进而调控其功能；向下解析了OsAGO2结合miR1875和miR172a调控OsHXK1和OsAPX1基因表达，从而调控水稻对稻瘟病的抗性。而对OsAGO2抗病机制的探索，为未来探索防控稻瘟病的方法提供了一个新的思路。
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