摘要
肌动蛋白细胞骨架（actincytoskeleton）是由微丝与肌动蛋白结合蛋白（actinbindingprotein，ABP）形成的动态网络结构，参与植物细胞的形态建成、极性生长、气孔运动和信号传递等生物学过程。肌动蛋白单体（G-actin）可以聚合形成多聚体微丝（F-actin），微丝则可以进一步组装形成高级结构——微丝束（bundle）。肌动蛋白结合蛋白可以动态精准调控微丝结构这三种形态的相互转变。绒毛蛋白（Villin）是一种属于Villin/Gelsolin/Fragmin超家族的ABP，具有催化肌动蛋白的成核、切割、加帽和聚合等生化活性。本实验室从棉花无长绒纤维突变体Li-1中鉴定了一个差异表达的绒毛蛋白，并将其命名为GhVLN4。GhVLN4蛋白在体内外均可以和actin结合，在生物体内显著促进F-actin捆绑成束。过表达GhVLN4可以显著提高裂殖酵母的长宽比，促进拟南芥花粉管的伸长，增强拟南芥对盐、干旱和大丽轮枝菌的抵抗力。过表达该基因还可以显著提高拟南芥水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径防御基因的表达。然而，关于GhVLN4如何调控植物响应生物和非生物胁迫过程中微丝骨架重构或基因表达重编程从而提高植物的抗逆性的分子细胞机理尚不清楚。 本研究通过病毒介导的基因沉默技术（virusinducedgenesilencing，VIGS）沉默棉花GhVLN4和在拟南芥中过表达GhVLN4，分析GhVLN4基因在植物应对盐、干旱、大丽轮枝菌胁迫中的功能。利用微丝专化荧光染料Phalloidin-iFluor?488Conjugate分析过表达GhVLN4对于拟南芥响应逆境胁迫过程中微丝骨架结构的调控作用；采用微球菌核酸酶超敏位点测序（MNasehypersensitivesitesequencing，MH-seq）技术分析异源表达GhVLN4对拟南芥染色质可及性的影响，研究微丝骨架调控植物基因表达的表观遗传学机制，主要结论如下： 1．沉默GhVLN4降低棉花对黄萎病抗性以及对干旱胁迫的响应。利用VIGS技术沉默棉花GhVLN4基因，发现沉默植株在接种大丽轮枝菌后出现严重的黄化、萎蔫及叶片脱落等现象，病情指数显著高于对照，叶绿素总量显著降低，且沉默植株上胚轴中的大丽轮枝菌含量显著高于对照。在干旱胁迫条件下，沉默GhVLN4植株叶片的气孔关闭速度减慢，相对电导率显著高于对照，说明沉默GhVLN4降低了棉花的抗病性与耐旱性。 2．过表达GhVLN4提高拟南芥对干旱和盐胁迫的耐性，维持微丝骨架高级结构。对野生型和过表达GhVLN4拟南芥株系进行盐和干旱处理，发现过表达植株的萎蔫减轻、减慢，莲座叶面积大于野生型，过表达植株的相对电导率和失水率显著低于对照，相对含水量显著高于对照。利用微丝专化荧光染料Phalloidin-iFluor?488Conjugate标记微丝骨架，荧光显微镜观察发现：野生型植株根部微丝在盐或干旱胁迫下发生解聚，从正常的连续、均匀、有序排列变化为散点状或短棒状弥散分布，而过表达植株中的微丝聚合成束，捆绑更加紧密。 3．过表达GhVLN4提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性，过表达GhVLN4可以减少微丝束的解聚和截断，使微丝骨架维持稳定的高级结构。用大丽轮枝菌Vd991侵染野生型和过表达GhVLN4拟南芥株系，在接种后的第10d和第15d，过表达株系的黄萎病病症较轻，莲座叶面积较大，病情指数显著低于野生型。过表达GhVLN4可加快Vd991或DC3000侵染过程中气孔的关闭速度。微丝聚合抑制剂LatB和Vd991处理拟南芥幼苗，均可导致野生型拟南芥根部微丝发生解聚与截断，大丽轮枝菌侵入点处的微丝解聚更为严重，呈弥散状分布。过表达GhVLN4可减轻大丽轮枝菌或LatB处理导致的微丝解聚与截断，保持紧密的成束排列，维持微丝骨架高级结构。 4．异源表达GhVLN4改变拟南芥全基因组染色质可及性，细胞骨架可能参与基因表达的表观遗传调控。对野生型和过表达GhVLN4拟南芥株系进行MH-seq测序，分别在全基因组水平鉴定到22,488和17,248个微球菌核酸酶超敏位点（MNasehypersensitivesite，MHS），其中共有410个差异MHS，关联178个基因。过表达GhVLN4改变了拟南芥全基因组的染色质可及性，提高了基因区开放染色质信号。通过STRINGDatabase对关联基因编码蛋白的互作关系进行分析，共识别出10个蛋白质互作子网，涉及植物的基因表达、细胞发育、物质运输、激素合成及胁迫响应等重要过程。GhVLN4蛋白可能通过调控植物微丝骨架，改变染色体可及性和基因表达，进而调节植物生长发育及抗逆性。
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