摘要
目的和意义：探讨壮腰健肾丸（ZYJSW）对快速老化SAMP6（SenescenceAcceleratedMouseProne6，P6）小鼠的骨保护作用，评价其对抗老年骨质疏松（Senileosteoporosis，SOP）的药效，并阐明ZYJSW的作用靶点与环节，为其防治SOP提供理论依据。 方法：4月龄P6雄性小鼠随机分为六组：模型组（P6，蒸馏水10ml/kg/d)；P6＋ZYJSW低剂量组（P6+L，0.765g/ml/kg）；P6＋ZYJSW中剂量组（P6+M，1.53g/ml/kg）；P6＋ZYJSW高剂量组（P6+H，3.06g/ml/kg）；P6+骨化三醇组（P6＋Cal，0.005mg/ml/kg）；P6+二甲双胍组（P6+Met，20mg/ml/kg）；SAMR1（耐快速老化，R1）小鼠为同窝对照小鼠组（R1，蒸馏水10ml/kg/d）。各组小鼠连续灌胃15周，每日观察其进食、饮水和活动情况。每7天测量一次体重，根据体重调整给药剂量。在取材前的第14天和第13天，小鼠颈部皮下注射四环素；在取材前的第4天和第3天，小鼠注射钙黄绿素，进行体内双荧光标记。 在实验终点，利用双能X线吸收法（Dual-emissionX-rayAbsorptiometry，DXA）测定全身骨密度（Bonemineraldensity，BMD）和骨矿含量（Bonemineralcontent，BMC）。取材，分别检测小鼠血清骨转换标志物、股骨生物力学、骨组织Micro-CT、骨组织形态计量学以及各脏器的病理学等各项指标的参数，对数据进行统计分析。通过Hamp;E染色、肌肉酶活力测定、Westernblot分析等方法评价肌肉质量；利用液质联用（LC-MS）技术分析ZYJSW中的有效成分，通过网络药理学和蛋白质组学预测相关机制，利用Westernblot实验进行验证。 结果： 一、ZYJSW对P6小鼠体重影响 与R1组小鼠相比，P6组小鼠第26周后体重快速增加，第28周后趋于稳定。与P6组小鼠相比，P6+H组，P6+Met组小鼠平均体重的波动较小，且P6+Met组第23周后龄体重低于各给药组。各组小鼠28周后，各组体重增加趋缓，变化平稳，且R1小鼠体重始终维持在最低水平。 二、ZYJSW毒性评价 1、脏器指数结果显示，各组小鼠脾，肝，肾脏器指数均在正常范围内。 2、肝脏、肾脏Hamp;E染色结果显示，各组小鼠肝脏细胞排列整齐，细胞质均匀，肝板界限明显，肝脏结构完整。与R1组小鼠相比，P6组小鼠肾脏出现炎症细胞浸润，而ZYJSW各给药组未见异常。 3、血清生化分析结果显示，各组小鼠血清中AST、ALT并无明显差异，均处于正常水平。与R1组小鼠相比，P6组小鼠血清Scr明显升高（P＜0.01），各给药组均出现不同程度下降，且中剂量和高剂量的降低较为明显（P＜0.001）。 三、ZYJSW对P6小鼠骨保护作用 1、通过DXA检测发现，与R1组小鼠相比，P6组小鼠全身BMD明显下降（P＜0.05）；与P6组小鼠相比，各给药组的BMD呈现上升趋势，但无统计学意义。与R1组小鼠相比，P6组小鼠全身BMC没有明显变化；与P6组小鼠相比，各给药组的BMC均显示增加趋势，且P6+Cal组BMC的差异具有统计学意义（P＜0.05）。 2、股骨Micro-CT结果显示，相比R1组小鼠，P6组小鼠骨小梁稀疏，网状结构破坏，骨微结构受损明显。各给药组骨小梁数量增多，排列密集，网状结构部分恢复，P6+H组变化最为显著。具体参数方面，P6组BV/TV（P＜0.01）、Tb.Th（P＜0.01）、Tb.N（P＜0.001）明显降低，Tb.Sp（P＜0.05）、SMI（P＜0.001）明显升高。与P6组相比，P6+L组SMI（P＜0.05）明显降低，P6+M组Tb.Sp（P＜0.05）、SMI（P＜0.001）明显降低，P6+H组BV/TV（P＜0.05）、Tb.Th（P＜0.01）、Tb.N（P＜0.01）明显升高，Tb.Sp（P＜0.05）、SMI（P＜0.01）明显降低，P6+Cal组BV/TV（P＜0.001）、Tb.Th（P＜0.001）、Tb.N（P＜0.001）明显升高，Tb.Sp（P＜0.01）、SMI（P＜0.001）明显降低，P6+Met组变化类似于P6+Cal组。 3、股骨生物力学实验结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠最大载荷、断裂载荷、刚性系数明显下降（P＜0.01）。与P6组小鼠相比，P6+L、P6+M、P6+H组的最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚性系数均呈现增加趋势，并且这种增加呈现出一定的剂量依赖性。各给药组中P6+Cal组的最大载荷（P＜0.01）、断裂载荷（P＜0.01）、刚性系数（P＜0.001）均呈现明显增加。 四、ZYJSW对P6小鼠骨代谢影响 1、血清中骨代谢标志物的变化显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠血清PINP水平明显减少（P＜0.001），而血清中CTX-I水平显著增加（P＜0.001）。与P6组小鼠相比，ZYJSW各给药组血清中的PINP水平表达升高，且呈剂量依赖性，其中P6+H组明显增加（P＜0.05），血清中的CTX-I水平在各给药组中均有显著降低（P＜0.001）。 2、胫骨上端骨形态计量学静态参数结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的Tb.Wi和Tb.N呈下降趋势，无统计学差异，P6组小鼠与R1小鼠相比，P6组小鼠%Tb.Ar明显下降（P＜0.05），Tb.Sp明显上升（P＜0.05）。与P6组小鼠相比，P6+L、P6+M、P6+H组小鼠的%Tb.Ar和Tb.Wi呈上升趋势，无统计学差异，P6+Cal组的%Tb.Ar明显升高（P＜0.05）。与P6组小鼠相比，各给药组小鼠的Tb.N均有所增加，其中P6+H和P6+Cal组显著增加（P＜0.01；P＜0.001）。而给药组的Tb.Sp均呈下降趋势，其中P6+M、P6+Cal和P6+Met组明显降低（P＜0.01；P＜0.001；P＜0.05）。 3、胫骨上端骨形态计量学动态参数变化结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV呈降低趋势，无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+L组的MAR、BFR/BS、BFR/BV数值略有降低，无统计学差异，而其他给药组均呈升高趋势，其中P6+M、P6+Cal、P6+Met组的BFR/BV明显升高（P＜0.05；P＜0.01；P＜0.05）。 4、胫骨上段松质骨成骨细胞和破骨细胞的变化结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的OC.N和Oc.Pm呈上升趋势，而Ob.Pm数值降低，无统计学差异。与P6组小鼠相比，各组小鼠的Ob.Pm均呈上升趋势，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+L、P6+H、P6+Met组小鼠的OC.N呈下降趋势，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+M、P6+Cal组小鼠的OC.N明显降低（P＜0.01；P＜0.05）。P6+H组的Oc.Pm呈下降趋势，但无统计学差异。另外，与P6组小鼠相比，P6+L、P6+Met、P6+M、P6+Cal组的Oc.Pm明显降低（P＜0.01；P＜0.001；P＜0.01；P＜0.001）。 5、胫骨中段骨形态计量学结果显示，胫骨中段骨内膜荧光的观察结果表明，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的双荧光较暗，荧光间距变窄。与P6组小鼠相比，各给药组的双荧光间距有所增加，荧光范围也更广。具体参数表现为，与R1组小鼠相比，P6组小鼠%E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS明显降低（P＜0.01；P＜0.001；P＜0.001）。与P6组小鼠相比，P6+L组小鼠的%E-L.Pm明显升高（P＜0.05），而E-MAR和E-BFR/BS呈升高趋势，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+M组小鼠的%E-L.Pm和E-MAR明显升高（P＜0.001；P＜0.001），而E-BFR/BS呈升高趋势，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+H组小鼠的%E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS均明显升高（P＜0.05；P＜0.001；P＜0.001）。与P6组小鼠相比，P6+Cal组小鼠的%E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS明显升高（P＜0.05；P＜0.001；P＜0.05）。P6+Met组小鼠的%E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS表现与P6+Cal组表现类似。 6、Westernblot的检测结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠骨形成相关蛋白OCN、OPG、BMP2、RUNX2的表达呈下降趋势，无统计学差异。与P6组小鼠相比，各组小鼠的OCN和RUNX2表达有所提高，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+L、P6+M、P6+H、P6+Cal各组小鼠的BMP2和OPG表达呈升高趋势，但无统计学差异；而P6+Met组的BMP2和OPG表达明显升高（P＜0.01）。与R1组小鼠相比，P6组小鼠骨吸收相关蛋白RANKL、TRAP、CTSK的表达呈上升趋势，但无统计学差异，而TRAF6的表达水平明显升高（P＜0.05）。与P6组小鼠相比，各组小鼠的CTSK和RANKL表达呈下降趋势，但无统计学差异，而各组小鼠的TRAF6表达水平明显降低，其中P6+M、P6+Cal、P6+Met组的TRAP蛋白表达明显降低（P＜0.05；P＜0.05；P＜0.01）。 五、生信分析结果 1、网络药理学结果表明，ZYJSW含有67个活性化合物和310个潜在靶点，最终确定了137个可能治疗SOP的潜在靶点。根据这些靶点的Degree值，确定了前17个关键基因，其中AKT1的Degree值最高。进一步分析发现，这些靶点涉及134个通路，其中与OP信号通路相关且排名靠前的为PI3K-AKT信号通路，最经典的Wnt信号通路也在其中。 2、蛋白质组学分析结果显示，与R1组小鼠相比，P6小鼠骨骼中共有266个基因表达异常，其中188个基因表达上调，78个基因表达下调。这些差异基因中，有31个位于线粒体中。差异基因涉及的通路共计291条，其中与OP信号通路相关且排名靠前的是PI3K-AKT信号通路和Wnt信号通路。同时，通过GO分析发现，这些差异基因与线粒体组织、肌肉组织密切相关。结果提示我们P6小鼠OP的发病原因可能与PI3K/Akt/Wnt信号通路以及线粒体功能有关。 3、ZYJSW有效成分分析结果显示，从ZYJSW中共鉴定出11个，可能是治疗SOP的有效成分活性化合物，分别为：原儿茶酸（Protocatechuicacid）、原儿茶醛（3,4-Dihydroxybenzaldehyde）、绿原酸（Chlorogenicacid）、咖啡酸（Caffeicacid）、长寿花糖苷（Roseoside）、金丝桃苷（Hyperoside）、异槲皮苷（Isoquercitrin）、特女贞苷（Specnuezhenide）、紫云英苷（Astragalin）、槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）。 六、验证预测的作用机制信号通路 1、ZYJSW参与了PI3K/Akt信号通路：与R1组小鼠相比，P6组小鼠的P-AKT和P-PI3K表达水平降低，但无统计学差异，而P-AKT/AKT的比值明显增加（P＜0.001）。与P6组小鼠相比，各给药组小鼠的P-PI3K/PI3K和P-AKT/AKT比值均明显降低，结果表明ZYJSW抑制了PI3K、Akt的磷酸化，从而调节PI3K/Akt信号通路。 2、ZYJSW调节Wnt信号通路：Westernblot结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的LRP5蛋白表达水平呈降低趋势，GSK3β表达增加，而β-catenin表达明显增加（P＜0.05），p-GSK-3β/GSK-3β明显降低（P＜0.01），P-β-catenin/β-catenin明显增加（P＜0.01）。与P6组小鼠相比，各给药组小鼠的LRP5表达水平呈升高趋势，其中P6+H组、P6+Met组小鼠的LRP5蛋白水平明显升高（P＜0.05）。各给药组的β-catenin含量明显升高，p-β-catenin/β-catenin明显下降。与P6组小鼠相比，各给药组的GSK-3β呈下降趋势，无统计学差异。其中P6+L组、P6+Met组的p-GSK-3β/GSK-3β呈升高趋势，无统计学差异，而P6+M组、P6+H组、P6+Cal组表达明显升高（P＜0.05）。 3、ZYJSW通过GCN5L1调控线粒体生成：与R1组小鼠相比，P6组小鼠的GCN5L1表达呈升高趋势，NRF-1和TFAM表达呈下降趋势，PGC-1α明显降低（P＜0.05）。与P6小鼠相比，各给药组小鼠的GCN5L1表达均降低，其中P6+Cal组、P6+Met组的表达明显降低（P＜0.05）。与P6组小鼠相比，除P6+L组外，各组小鼠的TFAM表达呈上升趋势，无统计学差异，各组小鼠的PGC-1α表达呈升高趋势。与P6组小鼠相比，各组小鼠的NRF-1表达升高，其中P6+M组、P6+H组明显升高（P＜0.05）。由此得出ZYJSW抑制GCN5L1会促进TFAM、PGC-1α、NRF-1等与线粒体生物生成相关蛋白的表达。 七、ZYJSW对P6小鼠肌肉质量影响 1、Hamp;E染色结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠肌细胞间隔较大且排列混乱，呈现出结构紊乱的现象，而各给药组中的结构异常均得到了一定程度的改善。 2、酶活性结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP酶活性明显下降（P＜0.001）。而ZYJSW各给药组则表现出酶活性的提高，其中P6+M（P＜0.05）、P6+H（P＜0.01）、P6+Cal（P＜0.001）、P6+Met（P＜0.001）具有的统计学差异。 3、Westernblot结果显示，与R1组小鼠相比，P6组小鼠的Ubiquitin(Ub)和MuscleRingFinger1(Murf1)的表达明显升高（P＜0.001；P＜0.05），而F-BoxProtein32（FBOX32）和Myogenin（Myog）呈升高趋势，但无统计学差异。与P6组小鼠相比，P6+L组小鼠的Murf1表达明显降低（P＜0.05），Ub呈下降趋势，但无统计学差异，P6+M组小鼠的Murf1和Ub表达明显降低（P＜0.001），P6＋H和P6+Cal组小鼠的Murf1表达明显降低（P＜0.001），Ub呈下降趋势，但无统计学差异，P6+Met组小鼠的Murf1和Ub表达明显降低（P＜0.001）。与P6组小鼠相比，各给药组的FBOX32和Myog均呈下降趋势，但无统计学差异。 结论：ZYJSW能够对抗快速老化P6小鼠骨代谢失衡导致的骨量丢失、骨微结构受损、骨生物力学性能降低，肌肉质量下降与功能减弱等现象，其骨保护的机制与调控GCN5L1介导的PI3K/Akt/Wnt信号通路有关。
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