摘要
骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种常见的慢性骨代谢疾病，其特征是骨微结构损坏，骨量下降，骨密度（Bonemineraldensity,BMD）降低，同时伴随着骨折风险增加。临床上用于治疗骨质疏松症的药物包括抑制骨吸收药物、促进骨形成药物以及其他补充剂等，但这些药物均存在用药周期长、副作用严重等缺点。因此，利用中药来治疗骨质疏松症已经成为新兴替代疗法。骨碎补总黄酮（TotalflavonoidsofRhizomaDrynariae,TFRD）是临床上骨科常用药，已有研究表明，TFRD及其活性单体柚皮苷（Naringin,Nar）、新北美圣草苷（Neoeriocitrin,Neo）和柚皮素（Naringenin,NG）在骨代谢方面发挥重要作用，但以往的研究多关注TFRD及其活性单体对成骨细胞（Osteoblast,OB）和破骨细胞（Osteoclas,OC）的影响，探索TFRD及其活性单体对骨细胞影响的研究较少。因此，我们探究了TFRD及其活性单体对骨细胞活性和骨代谢相关因子表达的影响，同时对比分析了TFRD及其活性单体的抗骨质疏松作用效果，深入分析了TFRD及其活性单体对骨细胞调控破骨细胞分化的影响和相关途径。 首先，我们鉴定了所用TFRD中活性单体Nar和Neo的含量。鉴于NG作为Nar的苷元，本研究利用高效液相色谱法（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）检测TFRD中两种含量最高的单体成分Nar和Neo的含量。该方法线性关系良好，精密度、重复率和回收率均符合要求。我们检测出每克TFRD中含有272.624mgNar和217.434mgNeo，占比均超过20%。 鉴于骨细胞是调控破骨细胞分化因子核因子κB受体活化因子（Receptoractivatorfornuclearfactor-κBligand,RANKL）的主要来源，但目前针对TFRD的活性单体对骨细胞影响的研究罕见。本研究系统分析了不同浓度Neo、NG和Nar对骨细胞活性的影响，明确三种单体刺激骨细胞的最适浓度。结果表明，5μMNeo、10μMNG和50μMNar显著刺激骨细胞活性。在此基础上，明确了三种活性单体在不同实验周期内对骨组织主要类型细胞，如骨细胞、成骨细胞和破骨细胞活性的影响。结果表明，Nar不同程度的抑制破骨细胞活性，并刺激骨细胞活性，但对成骨细胞活性的刺激作用不显著；长时间暴露于Neo中明显刺激成骨细胞和骨细胞活性，并抑制破骨细胞活性，这些结果显示出Nar与Neo对成骨和破骨的效用特征。 我们通过实时定量聚合酶链式反应（Realtime-polymerasechainreaction,RT-PCR）法检测Neo、NG和Nar处理后骨细胞内成骨抑制剂硬化蛋白（Sclerostin，SOST）、Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-1,DKK1）和破骨细胞分化关键因子RANKL基因的表达变化。结果表明，Neo和Nar能够显著抑制骨细胞中SOST和RANKL基因的表达；NG显著抑制了骨细胞中DKK1基因的表达。这些结果表明这三种单体在骨细胞调控成骨和破骨方面也具有一定作用。 接下来，我们以连续灌胃14天给予大鼠90mg?kg?1?day?1维甲酸（Retinoicacid，RA）的方式成功地复制了骨质疏松大鼠模型。经皮下注射0.1mg?kg?1?day?1阳性药阿仑膦酸钠（Alendronatesodium,Al），灌胃58mg?kg?1?day?1TFRD、50mg?kg?1?day?1NG和50mg?kg?1?day?1Nar，连续给药30天后，处死大鼠，收集大鼠血清、长骨和脊椎。实验中检测了血清中生化指标的变化，并通过苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosinstaining,Hamp;E）、Micro-CT、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrateresistantacidphosphatase,TRAP）染色、免疫组织化学染色、RT-PCR和Westernblot等实验检测了TFRD及其单体拮抗骨丢失、治疗骨质疏松的效应机制。在明确了TFRD、NG和Nar对大鼠的肝、肾功能没有明显影响的基础上，证明了TFRD、NG和Nar能一定程度的提高骨质疏松大鼠不同部位的骨密度，改善胫骨干骺端的微结构，降低骨组织中的骨细胞原位表达SOST蛋白的水平；同时，TFRD、NG和Nar处理也降低了骨组织内呈TRAP阳性的破骨细胞数量。这些结果反映了TFRD、NG和Nar的抑制骨吸收效应。在此基础上，本研究分析了不同实验组骨组织内成骨和破骨相关因子的表达变化。本研究发现了TFRD、NG和Nar显著抑制了骨组织内SOST基因的表达，同时不同程度刺激了成骨调控因子Wnt10b和β-catenin基因的表达，提示其可能通过Wnt/β-catenin信号通路刺激成骨。在破骨方面，TFRD和Nar均显著抑制了骨组织中TRAP基因的表达。我们检测了这些骨形成和骨吸收相关因子在蛋白水平的变化，可以看出TFRD、NG和Nar降低了骨组织中SOST、TRAP、RANKL和核因子κB受体活化因子（Receptoractivatorofnuclearfactor-kappaB,RANK）蛋白的表达水平，而Nar可显著提高成骨相关的碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）和甲状旁腺素受体1（Parathyroidhormone1receptor,PTH1R）蛋白的表达水平。从基因和蛋白水平上验证了TFRD、NG和Nar不仅可以降低骨吸收，还可以通过抑制骨细胞分泌的SOST刺激骨形成。这些结果证明了TFRD、NG和Nar拮抗骨质疏松效应及其对骨形成和骨吸收的作用特征，其中Nar的作用效果更好。 本研究已观察到TFRD的单体NG和Nar不同程度地抑制骨组织内调控破骨细胞分化的相关蛋白表达，但TFRD对其直接抑制作用不明显，所以本研究进一步分析了TFRD、NG和Nar对骨细胞调控破骨细胞功能的影响。我们借助Transwell小室将骨细胞与破骨细胞进行共培养，利用地诺单抗（Denosumab，DMAb）作为阳性对照药物，通过TRAP染色、鬼笔环肽（Phalloidin）染色和分子生物学技术观察上层破骨细胞分化情况以及破骨细胞分化标志物及关键调控因子的表达变化。结果表明，TFRD、NG、Nar和阳性药能够抑制破骨细胞中活化T细胞的核因子c1（NuclearfactorofactivatedTcellsc1,NFATc1）的表达，其中Nar和阳性药的抑制效应更明显；NFATc1上游RANK的表达在NG、Nar和阳性药组均显著降低；与之相应地，Nar和阳性药对CTSK和TRAP的抑制作用较TFRD和NG强，能够明显抑制破骨细胞分化。综合上述结果可以看出，TFRD、NG和Nar通过降低RANK/NFATc1通路来抑制骨细胞调控破骨细胞分化，其中Nar对破骨细胞分化的抑制作用明显优于TFRD和NG，且抑制效应更接近于阳性药。 综上所述，本研究阐明了TFRD及其单体NG和Nar具有良好的抗骨质疏松效用，且Nar是一种更有前途和更安全的骨保护剂。此外，本研究发现了Nar不仅可以直接抑制骨吸收，也可通过影响骨细胞调控破骨细胞分化进而发挥抑制破骨细胞功能的作用。
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