摘要
哺乳动物的早期胚胎发育是一个复杂且精密的生物学过程，涉及大量基因转录和功能的精准调控及复杂的表观遗传调控。近年来研究发现，组蛋白修饰酶在早期胚胎发育过程中发挥调节组蛋白修饰、染色质结构和基因转录等一系列关键作用。组蛋白去甲基化酶——赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysinespecificdemethylase1，LSD1）可以对组蛋白H3K4me1/2和H3K9me1/2及非组蛋白底物进行去甲基化修饰，参与调控基因转录等多种基本生命活动，但LSD1在猪早期胚胎发育中的作用与机制有待于深入研究。本研究旨在探究LSD1对猪早期胚胎发育的影响及调控机制，以期为提高猪早期胚胎发育效率、改善胚胎质量、减少胚胎死亡和丢失提供理论依据。 为解析LSD1在早期胚胎发育过程中的潜在功能和作用机制，本研究以猪早期胚胎为实验材料，通过LSD1抑制剂GSK-LSD1处理，明确LSD1在猪早期胚胎发育中发挥重要作用。抑制猪早期胚胎LSD1后进行转录组学测序，基于获得差异基因进行功能富集分析，筛选出LSD1主要通过细胞自噬影响猪早期胚胎发育。通过RT-qPCR、IF和WB等进行功能验证实验，阐明LSD1通过介导mTOR通路调控细胞自噬进而影响猪早期胚胎发育的作用机制。本研究具体结果如下： 1.LSD1定位在猪早期胚胎的细胞核且在猪早期胚胎发育各阶段均有表达。 2.抑制LSD1后降低猪孤雌激活胚胎和体外受精胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚直径，并降低多能性标志基因OCT4、SOX2、KLF4和NANOG的mRNA和蛋白水平。 3.抑制LSD1提高猪早期胚胎中H3K4me1/2和H3K9me1/2甲基化修饰水平。 4.抑制LSD1诱导猪早期胚胎DNA损伤和细胞凋亡，上调DNA损伤标志蛋白γH2AX和DNA损伤应答基因（ATM和ATR）水平，下调DNA双链断裂修复途径相关基因（BRCA1、53BP1、XRCC6和PRKDC）的mRNA水平；并上调了TUNEL阳性细胞比率和凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8和Caspase9水平，下调了BCL2/BAX的水平。 5.生物信息学分析获得抑制LSD1后猪早期胚胎中的差异表达的基因，共鉴定到差异基因2,992个，其中1,347个上调，1,645个下调，差异基因显著富集在核糖体、吞噬体-溶酶体融合、自噬、细胞凋亡和mTOR等信号通路。 6.抑制LSD1导致猪早期胚胎细胞自噬水平升高，降低猪早期胚胎中p-mTOR/mTOR，上调p-ULK1/ULK1；并上调了自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和p62以及自噬相关基因（ATG5、ATG7、ATG16和ATG101）水平。 7.mTOR激活剂通过抑制自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和p62以及自噬相关基因（ATG7和ATG101）水平，并上调BCL2/BAX，下调Caspase8的蛋白水平，恢复抑制LSD1引起的猪早期胚胎发育率降低。 8.抑制LSD1诱导的自噬主要发生于线粒体，降低线粒体膜电位和ATP水平，ROS水平升高。 综上所述，本研究明确了LSD1在猪早期胚胎发育过程中的表达模式及其通过mTOR通路调节细胞自噬影响猪早期胚胎发育的机制。研究结果将有助于更深入的了解LSD1在猪早期胚胎发育过程中所起的调控作用及潜在功能，丰富对猪早期胚胎发育分子调控机制的认识，也为进一步提高猪早期胚胎发育效率、改善胚胎质量、减少胚胎死亡和丢失提供理论基础。
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