摘要
新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）是一类单股、负链、不分节段的副黏RNA病毒。根据其毒力差异，可分为强、中及弱毒株三种类型，其中强毒株感染易感禽类可导致新城疫（Newcastledisease，ND），其临床表现为呼吸道、消化道及中枢神经系统症状，致死率高达100%。目前ND持续危害并限制全球养禽业发展，造成严重的经济损失，是养禽业重点监测和防控的重要动物传染病。因此对NDV致病机理的诠释可为ND防治提供理论基础和技术支持。 促凋亡蛋白BAK1（BCL-2antagonist/killer1），又称BAK，是宿主细胞线粒体凋亡途径中的一种关键蛋白，可参与影响病毒感染所引发的先天免疫反应和炎症反应，以协助机体清除病毒的感染。目前BAK1在多种病毒复制中的作用研究已有报道，然而关于宿主BAK1在NDV复制中的功能则鲜有探究。 本研究基于前期转录组测序数据，筛选出NDV感染后显著差异表达的免疫相关基因BAK1，探究BAK1在NDV复制中的功能及其作用机制。研究结果将丰富宿主应对NDV感染的作用机制研究，为ND防治提供理论依据和参考。 本论文的主要研究内容如下： 1、宿主BAK1基因与NDV复制相关性研究 基于前期转录组测序数据，筛选出显著差异表达的免疫相关基因BAK1进行深入研究。经q-PCR检测，NDV感染使BAK1的转录水平显著上调，与测序结果一致。为进一步探究NDV感染后宿主BAK1在体内、外是否存在转录差异并探究BAK1在体外的动态表达情况，分别利用NDV感染鸡巨噬细胞HD11和鸡成纤维细胞DF-1，并于感染后6、12、18、24及30h进行q-PCR检测，结果显示，体内、外感染模型中BAK1的转录趋势一致，且在6~24hpi呈现时间正相关，提示BAK1可能对NDV复制存在一定影响。 构建BAK1过表达真核质粒，同时设计并合成靶向BAK1的siRNA，将其分别转染至HD11细胞后再感染NDV，并利用q-PCR、TCID50和Westernblot等实验分析BAK1与NDV复制的相关性。结果显示，过表达BAK1显著抑制NDV复制，而抑制BAK1的表达则显著促进NDV复制。由此可见，宿主BAK1基因与NDV复制呈负相关性。 2、宿主BAK1基因在NDV复制中的作用机制研究 为验证宿主BAK1基因是否通过调节宿主细胞凋亡以调控NDV复制，分别对HD11细胞进行过表达及沉默BAK1处理后感染NDV，并设置未攻毒对照组，利用caspase-3活性检测、Hoechest核染色、q-PCR和Westemblot等实验来检测细胞的凋亡情况。Caspase-3活性检测和Hoechest核染色结果均显示宿主BAK1基因的过表达显著促进NDV感染诱导的HD11细胞凋亡。与此同时，检测线粒体凋亡通路关键分子的mRNA及蛋白水平发现，宿主BAK1的表达与促凋亡蛋白（BAX、Cytc、caspase-9、caspase-7和caspase-3）的表达呈正相关性，但与抗凋亡蛋白BCL-2的表达呈负相关性。由此可见，宿主BAK1可通过影响线粒体凋亡以实现对NDV复制的调控。 接下来为探究宿主BAK1是否可通过调节宿主先天免疫关键分子的表达以参与对NDV复制的调控，利用q-PCR检测上述感染细胞模型中干扰素信号通路关键分子及炎性因子的转录水平。结果表明，在NDV复制过程中，诸多干扰素信号通路关键分子（IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MDA5、MAVS、TBK1、STING、IRF7、IRF1、NF-κB、MyD88、OAS、MX1、PKR、ISG15、IFITM1及IFI27L2）和炎性因子（TNF-a、IL6、IL1β）的转录水平与宿主BAK1的转录水平呈显著正相关，其中尤以IFI27L2最为显著，且发现BAK1与IFI27L2存在相互调控关系。以上结果表明，BAK1可通过影响干扰素信号通路关键分子及炎症因子的转录水平以参与对NDV复制的调控。 综上所述，NDV感染机体后诱导宿主BAK1表达水平显著上调。BAK1一方面可促进NDV感染诱导的细胞线粒体凋亡，另一方面可促进干扰素、干扰素信号通路标志分子及炎性因子的释放，增强宿主的先天免疫水平，进而发挥对NDV增殖的抑制作用。本研究从宿主BAK1的角度揭示了宿主抗NDV感染的作用机制，有助于寻找病毒复制关键因子并为ND防治提供理论基础和技术支持。
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