摘要
棉蚜（AphisgossypiiGlover）是一种世界性害虫，通过吸食汁液和传播病毒为害寄主植物，目前的防治措施主要是施用杀虫剂。长期不合理的使用杀虫剂是棉蚜产生抗药性的重要原因之一。溴氰虫酰胺具有较好的内吸性，作用于昆虫鱼尼丁受体，可防治多种咀嚼式及刺吸式口器害虫。目前，关于棉蚜对溴氰虫酰胺抗性的田间报道较少，然而已有研究通过室内连续筛选使棉蚜对该杀虫剂产生中等水平抗性，因此棉蚜对这类药剂可能产生的抗性风险不容忽视。细胞色素P450介导的代谢抗性是昆虫重要的抗药性机制之一，因此P450基因转录水平升高在昆虫抗药性产生过程中扮演极其重要的角色。本文利用转录组测序分析筛选CyR品系棉蚜中肠及剩余组织中上调的P450基因，并通过RT-qPCR验证P450基因在中肠及剩余组织中表达量。利用转基因果蝇和RNAi技术探究候选P450基因在解毒代谢中的作用，最后通过酵母单杂交、EMSA和RNAi试验研究关键P450基因的转录调控机制。主要研究结果为： 1、根据SS和CyR品系棉蚜中肠和剩余组织转录组数据，与SS品系相比，CyR品系中共有3142个差异表达基因，其中中肠有193个基因上调，剩余组织有1626个基因上调。选择13个丰度较高且表达上调的P450基因进行下一步研究，利用RT-qPCR验证其表达量。结果显示，CYP4CK1、CYP4G51、CYP6CY5，CYP6CY9、CYP6CY14、CYP6CY18、CYP6CY19、CYP6CY22、CYP6CZ1、CYP6DA1、CYP6DB1、CYP6DC1和CYP6DD1在CyR品系中表达升高，并且CYP6CY18、CYP6CY22、CYP6CZ1和CYP6DA1在中肠中表达量显著高于剩余组织。 2、利用转基因果蝇和RNAi对候选P450基因的解毒代谢功能进行验证。转基因果蝇的点滴生物测定结果表明，CYP4CK1、CYP6CY5、CYP6CY9、CYP6CY22和CYP6DA1在黑腹果蝇全虫体过表达对溴氰虫酰胺的耐受性分别提高了4.8倍、4.6倍、6.32倍、4.24倍和12.24倍，其中Act5Cgt;UAS-CYP6DA1转果蝇品系对溴氰虫酰胺的耐受性显著高于其他品系。棉蚜中肠表达上调的P450基因CYP6CY18、CYP6CY22、CYP6CZ1和CYP6DA1在转基因果蝇的胃毒生物测定中也都表现出了超过3倍的耐受性。通过RNAi分别抑制CYP4CK1、CYP6CY5、CYP6CY9、CYP6CY22和CYP6DA1的表达后，CyR品系棉蚜对溴氰虫酰胺的敏感性显著升高。此外，qPCR结果表明溴氰虫酰胺处理后，CYP6CY5和CYP6CY9的表达量受到诱导而显著升高。这些结果表明候选P450基因在棉蚜对溴氰虫酰胺的抗药性中发挥重要作用。 3、根据转基因果蝇生物测定和RNAi结果，明确了关键基因CYP6CY22和CYP6DA1过表达参与对溴氰虫酰胺的解毒代谢过程，本研究通过酵母单杂交、RNAi以及EMSA等手段深入探究其转录调控机制。结果发现，转录因子CF2-II的选择性剪接体CF2-II-AS与CYP6CY22的5’侧翼区域特异结合。系统进化分析表明，CF2-Ⅱ-AS与甘蔗蚜（Melanaphissacchari）和豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum）的锌指蛋白关系最为密切。并且在CyR品系棉蚜中沉默CF2-Ⅱ-AS后，CYP6CY22的表达量降低了22%。这些结果表明CF2-Ⅱ-AS与CYP6CY22的5’侧翼区域结合，从而调控CYP6CY22的转录水平。此外，序列分析表明，棉蚜的CROC基因可能是双向转录的，编码两个转录本，即CROC(+)和CROC(-)，而属于FoxC家族的含叉头结构域转录因子CROC(-)与CYP6DA1的5’侧翼区域也有结合作用，EMSA结果也证实了转录因子CROC(-)通过与CYP6DA1的5’侧翼区域结合，并且沉默CyR品系棉蚜CROC(-)后，CYP6DA1的表达量降低89%，表明CROC(-)参与了CYP6DA1的调控，从而增强棉蚜对溴氰虫酰胺的抗性。 综上所述，本研究通过分析CyR和SS品系棉蚜的中肠及剩余组织的转录组，利用转基因果蝇及RNAi明确了候选P450基因介导棉蚜对溴氰虫酰胺的抗药性。此外利用酵母单杂交和EMSA证实了转录因子CF2-Ⅱ-AS和CROC(-)分别与CYP6CY22和CYP6DA1的5’侧翼区域结合，调控P450基因CYP6CY22和CYP6DA1的表达。本文丰富了P450基因过表达调控昆虫对双酰胺类杀虫剂产生抗性的研究论据，并为反式作用因子介导P450基因转录水平变化的转录调控机制提供依据。
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