摘要
目的和意义： 确定Mayamycin对三阴性乳腺癌（TNBC）的抑制作用，检测Mayamycin发挥抗TNBC活性的功能，揭示Mayamycin抗TNBC的作用机制，验证Mayamycin体内抗TNBC效果。 方法： 采用CCK8试剂检测Mayamycin在TNBC细胞（MDA-MB-231和BT-549）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）的细胞毒活性并计算IC50。使用流式细胞术和EdU试剂检测Mayamycin对TNBC细胞周期、增殖和凋亡的影响。利用Transwell实验确定Mayamycin对TNBC细胞侵袭、转移等功能的影响。通过构建异种移植瘤模型验证Mayamycin体内抗TNBC效果。结合基因测序和TNBC的scRNA-seq数据库，分析TNBC中特异激活、明显异常表达且与疾病预后密切相关的下游通路基因。运用靶点预测工具Autodockvina预测Mayamycin的结合位点，通过细胞热位移实验验证预测的结合位点。采用siRNA和Westernblot实验证实Mayamycin抗TNBC的作用机制。 结果： 1.与临床常用化疗药物顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。研究发现，Mayamycin对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的IC50值为5.76μM，而对TNBC细胞的IC50值分别为0.88和1.43μM，该差异具有统计学意义，表明与正常乳腺上皮细胞相比，Mayamycin对TNBC细胞具有较好的选择性细胞毒活性。此外，临床常用化疗药物顺铂对TNBC细胞的细胞毒活性和选择性均较差。上述结果表明与顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。 2.Mayamycin能够导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。用Mayamycin分别处理TNBC细胞24h后，流式细胞术检测发现随着Mayamycin浓度增加，细胞周期的S期占比增加，EdU染色阳性的细胞数量明显减少，证实了Mayamycin可导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。 3.Mayamycin能够诱导TNBC细胞的凋亡。采用流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，随Mayamycin浓度增加或作用时间延长，TNBC细胞的凋亡率逐渐增加。Westernblot实验结果发现Bax/Bcl-2比值上升，证实了Mayamycin可以诱导TNBC细胞Bax/Bcl-2介导的凋亡。 4.Mayamycin能够有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。通过Transwell转移实验和基质胶侵袭实验，发现Mayamycin处理24h后，MDA-MB-231和BT-549细胞的侵袭和转移能力明显随着浓度的增加而降低。针对影响侵袭和转移关键蛋白的Westernblot实验结果证实了Mayamycin可有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。 5.Mayamycin具有体内抗三阴性乳腺癌功能。利用荷瘤小鼠提供体内环境检测Mayamycin的体内抗TNBC效果。结果表明，Mayamycin在剂量为2mg/kg和4mg/kg治疗荷瘤小鼠时可有效抑制小鼠皮下TNBC肿瘤的生长，联合顺铂治疗，肿瘤生长抑制效果优于单独使用Mayamycin或顺铂。证实了Mayamycin具有体内抗三阴性乳腺癌功能。 6.通过检测Mayamycin处理前后MDA-MB-231的转录组学测序联合TNBC的scRNA-seq数据进行生物信息学分析，发现Mayamycin可以下调TNBC细胞中疾病预后相关基因STMN1的表达。 7.下调STMN1的表达抑制TNBC细胞的侵袭和转移。小干扰RNA抑制TNBC细胞的STMN1基因表达后检测TNBC细胞的转移侵袭水平情况，证实了下调STMN1可抑制TNBC细胞的侵袭和转移。 8.Mayamycin可结合CDK7。Autodockvina软件对人类蛋白分子预测结构与Mayamycin分子进行批量模拟对接，发现Mayamycin与CDK7存在结合位点，具有较低的结合能。细胞热位移实验结果表明Mayamycin可提高CDK7的稳定性，证明Mayamycin可与CDK7结合，形成配体-蛋白质复合物。 结论： 本研究发现，Mayamycin对TNBC具有选择性的细胞毒活性。Mayamycin具有抑制TNBC细胞周期进程、增殖、侵袭转移和促进TNBC细胞凋亡的功能。Mayamycin可直接结合CDK7蛋白，以及通过下调STMN1表达抑制TNBC细胞侵袭迁移。本研究首次证明Mayamycin具有体内抑制TNBC肿瘤生长效果。
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