摘要
目的： 1.分析间α-胰蛋白酶抑制剂重链2（inter-alpha-trypsininhibitorheavychain2,ITIH2）在非小细胞肺癌（nonsmallcelllungcancer，NSCLC）组织中的表达水平与肿瘤TNM分期和预后的相关性。 2.探讨ITIH2在NSCLC细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）中的作用及其潜在分子机制，为NSCLC的治疗提供潜在靶点。 方法： 1.通过组织芯片分析NSCLC与癌旁组织中ITIH2的表达差异及其与肿瘤TNM分期和预后的相关性。 2.采用Westernblot检测ITIH2在NSCLC细胞（A549、H460、H1299、H1975、95C、95D）及正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）中的表达水平。 3.选择低表达ITIH2的NSCLC细胞（95C），采用慢病毒感染技术过表达ITIH2。实验共分为三组，即对照组（简称：Control）、空载体感染组（简称：LV-NC）和ITIH2过表达组（简称：LV-ITIH2）。感染72h后，显微镜下观察感染效率，将细胞继续培养于含2μg/mL浓度的嘌呤霉素的培养液中，进行单克隆稳定株筛选，采用Westernblot鉴定筛选效果，选择鉴定结果正常的单克隆细胞进行MTT实验、平板克隆实验和Transwell小室实验分析ITIH2对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并通过Westernblot检测EMT上皮标志物（E-cadherin）、间质标志物（N-cadherin、Vimentin）和转录因子Slug的表达情况。 4.选择高表达ITIH2的NSCLC细胞（95D），采用RNA干扰技术敲低ITIH2的表达，实验共分为三组，即模拟转染组（简称：MOCK）、阴性转染对照组（简称：Si-NC）和ITIH2-SiRNA转染组（简称：Si-ITIH2）。瞬时转染24h后，通过MTT实验和平板克隆实验分析ITIH2对NSCLC细胞增殖能力的影响；通过Transwell小室实验分析ITIH2对NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响。瞬时转染48h后，采用Westernblot检测敲低效果及EMT上皮标志物（E-cadherin）、间质标志物（N-cadherin、Vimentin）和转录因子Slug的表达情况。 5.采用Westernblot分析ITIH2在NSCLC细胞EMT进程中对MEK/ERK信号通路激活的影响。 6.各处理组用ERK信号通路特异性抑制剂PD98059预处理后，通过Westernblot分析EMT相关蛋白的表达情况。 7.采用CRISPR/Cas9技术稳定敲除95D细胞中的ITIH2，并通过Westernblot进行敲除效果验证。 8.动物实验：分别构建ITIH2稳定过表达95C细胞株及ITIH2稳定敲除95D细胞株，将其分别注射入裸鼠皮下，观察ITIH2对NSCLC移植瘤生长的影响，并通过免疫组化实验分析EMT相关蛋白的表达情况。 结果： 1.NSCLC组织芯片结果显示：95例NSCLC组织中，46例为ITIH2高表达，49例为ITIH2低表达；79例癌旁组织中，0例为ITIH2高表达，79例为ITIH2低表达。根据Mann-Whitney检验可知，ITIH2蛋白在NSCLC组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.001）；根据Fisher检验可知，ITIH2蛋白在各TNM分组中表达不同（P＜0.05）；根据COX多因素回归分析结果可知，病理分级与NSCLC预后显著相关（P＜0.05），可作为影响NSCLC患者预后的独立因素；根据Kaplan-Meier生存分析结果可知，ITIH2蛋白高表达与NSCLC预后不良显著相关（P＜0.05）。 2.Westernblot结果显示，与正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）相比，H460和95C细胞中ITIH2表达水平差异不明显，其他NSCLC细胞（A549、H1299、H1975、95D）ITIH2表达水平上调，其中95D细胞ITIH2表达水平上调最显著。 3.与Control组和LV-NC组比较，LV-ITIH2组95C细胞的ITIH2表达水平明显上调（P＜0.01），且显著提高了95C细胞的增殖、迁移和侵袭能力；同时LV-ITIH2抑制了EMT上皮标志物（E-cadherin）的表达水平，促进了EMT间质标志物（N-cadherin、Vimentin）和转录因子（Slug）的蛋白表达水平（P＜0.05）。 4.与MOCK组和Si-NC组比较，Si-ITIH2组95D细胞的ITIH2表达水平明显下调（P＜0.05），且显著降低了95D细胞的增殖、迁移和侵袭能力；同时Si-ITIH2促进了EMT上皮标志物（E-cadherin）的表达水平，抑制了EMT间质标志物（N-cadherin、Vimentin）和转录因子（Slug）的蛋白表达水平（P＜0.05）。 5.与Control组和LV-NC组相比，95C细胞LV-ITIH2组中的MEK和ERK1/2表达无明显变化，p-MEK和p-ERK1/2表达明显上调（P＜0.05）；与MOCK组和Si-NC组相比，95D细胞Si-ITIH2组中的MEK和ERK1/2表达无明显变化，p-MEK和p-ERK1/2表达明显下调（P＜0.05）；这些结果表明过表达ITIH2后，MEK/ERK信号通路可被激活，敲低ITIH2后，MEK/ERK信号通路受到抑制。 6.与Control组、LV-ITIH2组和PD98059组相比，95C细胞LV-ITIH2＋PD98059组中E-cadherin表达下调；与Control组、LV-ITIH2＋PD98059组和PD98059组相比，95C细胞LV-ITIH2组中N-cadherin和Vimentin表达上调。与Si-ITIH2组、Si-ITIH2＋PD98059组和PD98059组相比，95D细胞Control组中E-cadherin表达下调而N-cadherin和Vinmentin表达上调；与Control组、Si-ITIH2＋PD98059组和PD98059组相比，95D细胞Si-ITIH2组中E-cadherin表达上调，表明ERK抑制剂PD98059可能抑制NSCLC细胞EMT的进程。 7.Sanger测序和Westernblot分析结果都显示95D细胞中的ITIH2被成功敲除。 8.与Control组和LV-NC组相比，LV-ITIH2组的95C细胞NSCLC移植瘤体积和瘤重更大，表明过表达ITIH2能够促进NSCLC移植瘤的生长；与对照组（简称：Control）相比，ITIH2敲除组（简称：ITIH2-KO）95D细胞NSCLC移植瘤体积和瘤重更小，表明敲除ITIH2能够抑制NSCLC移植瘤的生长。免疫组化结果显示，与Control组和LV-NC组相比，LV-ITIH2组的EMT上皮标志物（E-cadherin）阳性细胞占比较低，间质标志物（N-cadherin、Vimentin）和转录因子（Slug）阳性细胞占比较高；与Control组相比，ITIH2-KO组E-cadherin阳性占比较高，N-cadherin、Vimentin和Slug阳性占比较低，表明过表达ITIH2可促进NSCLC移植瘤的生长和EMT的进程。 结论： ITIH2在NSCLC组织中高表达，且NSCLC组织中ITIH2高表达与预后不良呈显著相关；ITIH2可促进NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，其机制可能与MEK/ERK信号通路激活有关。
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