摘要
达氟沙星（Danofloxacin）为第三代人工合成的氟喹诺酮类兽用抗菌药物，具有吸收好，体内分布广泛，生物利用度高等优点，已广泛应用于经济动物的细菌病治疗中。 黄河鲤鱼（Cyprinuscarpiohaematoperus）是我国特色的淡水鱼类品种，具有重要的食用价值和种质研究价值，其抗病性和适应性强、营养丰富、味道鲜美，深受养殖户和消费者的喜爱。随着养殖规模的扩大，养殖集约化、种质资源的退化导致了黄河鲤鱼疾病的爆发，抗生素的应用也更加频繁，随之而来的药物残留问题受到了人们关注。然而关于达氟沙星在黄河鲤鱼体内药动学和组织分布研究未见相关报道，为规范指导达氟沙星在黄河鲤鱼中的用药，本文首先建立了一种能够准确定量黄河鲤鱼血浆、胆汁、皮肉等组织内达氟沙星含量的高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）检测方法，并在此方法的基础上研究了单次口灌达氟沙星在健康黄河鲤鱼体内的药代动力学特征以及连续5d多次口灌后的残留消除规律，并根据鱼肉中的最高残留限量（Maximumresiduelimit，MRL）制定合理的休药期。 1.达氟沙星在黄河鲤鱼血浆和组织中检测方法的建立 建立了一种能够准确定量黄河鲤鱼血浆、皮肉、胆汁、肝脏、肾脏、鳃和肠组织中达氟沙星含量的前处理方法及HPLC检测方法。使用乙腈、三氯甲烷或酸化乙腈作为提取液分别净化血浆、胆汁和其他组织样品，之后采用高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）进行检测。结果表明，达氟沙星在黄河鲤鱼血浆及组织样品中的保留时间约为6.8min，响应峰峰形尖锐无拖尾，且在响应处附近无杂峰干扰；达氟沙星浓度在0.005~16μg/mL(g)的线性范围内与峰面积之间线性关系良好，相关系数R2均大于0.999；各组织中的达氟沙星的回收率均在80.11%~106.91%之间；日内和日间变异系数分别在0.79%~10.68%和2.07%~8.99%之间，符合兽药法规文件要求；达氟沙星的在各组织的检测限为0.002~0.02μg/mL(g)，定量限为0.005~0.02μg/mL(g)。经本实验优化后的方法，其操作简便、定量准确、回收率高，能够满足黄河鲤鱼血浆及组织中达氟沙星浓度的准确定量。 2.单次口灌达氟沙星在黄河鲤鱼体内的药代动力学 在水温23.7±1.2℃条件下，健康黄河鲤鱼单次口灌10mg/kg.bw（Bodyweight）达氟沙星后。采用稀疏采样法，在给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24、36、48、72、96、120和144h，每个时间点随机选取6条鲤鱼采集血浆样本，每条鲤鱼采集四个血浆样品，然后用HPLC法测定血浆中达氟沙星的浓度。结果表明，给药后120h内，可以准确地定量血浆中的达氟沙星。根据非线性混合效应模型法（Nonlinearmixedeffectmodel，NONMEM）建立了相应的群体药代动力学模型。包括协变量（体重）和协方差模型，以解释药动学参数未知来源的一些变异，提高模型的预测能力。在稀疏采样的前提下，群体药代动力学模型准确描述了群体的典型值（固定效应）和个体间变异（随机效应）。吸收速率常数（tvKa）、表观分布容积（tvV）和清除率（tvCL）的典型值和个体间变异系数（CV%）分别为2.48h-1和0.203%、47.8L/kg和8.40%、0.694L/h/kg和4.35%；消除半衰期（t1/2λz）和药时曲线下面积（AUC0-?）分别为47.7h和14.4h·μg/mL。根据计算得到的AUC/MIC或Cmax/MIC的PK/PD指数，以目前的达氟沙星口服剂量（10mg/kg.bw）可以抑制MIC≤0.016μg/mL的病原体。然而，需要进一步地研究来确定达氟沙星对黄河鲤鱼中分离的病原体的体外和体内抗菌效果，并最终得出合理的给药方案。 3．多次口灌达氟沙星在黄河鲤鱼体内的残留消除规律 在17.8±0.7℃淡水中饲养的黄河鲤鱼经连续5d口灌10mg/kg.bw达氟沙星，在最后一次给药后的1、4、8、12h、1、2、3、5、7、10、13、16和19d采集不同样品，包括血浆、胆汁、皮肉、肝脏、肾脏、鳃和肠，并采用HPLC方法对所有采集样品中的达氟沙星浓度进行定量。结果表明，达氟沙星广泛分布于鲤鱼体内，可在所有组织中检测到，且胆汁中观察到的最高浓度（Cmax=8.149μg/mL）明显高于其他组织。在最后一次给药后的0~24h内，观察到达氟沙星的吸收和分布出现多峰现象。然而，24h后，各组织中的药物浓度逐渐降低。最后一次给药后第13d（312h），除血浆和皮肉外，其他组织中仍能检测到药物残留。使用非房室模型计算得到药代动力学参数值，达氟沙星在不同样品中的t1/2λz从快到慢依次为皮肉（47.89h）、血浆（59.11h）、肾脏（63.54h）、鳃（104.61h）、肠（106.25h）、肝脏（109.43h）和胆汁（170.24h）。根据达氟沙星在鱼类皮肉中规定的MRL（0.1μg/g），基于单侧95%置信区间的上限，最终确定休药期为10d，转换单位后为162度日（℃*d）。
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