摘要
稻瘟病是水稻生产中最严重和最具破坏性的病害之一，每年导致10～30%的水稻产量损失。培育水稻抗病品种是目前防治稻瘟病最经济、有效和可持续的方法。稻瘟病在水稻的各生长阶段均可发生，尤其是穗瘟对水稻产量和品质的影响更大，严重时可导致水稻绝产，带来巨大的经济损失。目前已经克隆了30多个稻瘟病抗性基因，大多是苗瘟或叶瘟抗性基因，具有穗瘟抗性的基因只有Pb1、Pigm、Pi64和Pi25及等位基因Pid3和Pid3-A4。挖掘更多具有广谱抗性的穗瘟抗性基因并对水稻稻瘟病抗性机制进行解析和培育穗瘟抗性品种具有重要意义。 本研究在实验室前期研究的基础上，从具有广谱抗性的太湖流域粳稻地方品种江南晚中克隆了一个兼抗穗瘟和苗瘟基因Pb-jnw1，并对其功能进行初步分析；同时对水稻一个SNARE蛋白OsNPSN11参与抗稻瘟病过程的分子机理进行了初步解析。主要研究结果如下： 1、粳稻江南晚（Jiangnanwan）抗稻瘟病基因Pb-jnw1的克隆与功能验证 （1）以含有穗瘟抗性基因Pb-jnw1的家系NIL18为材料，与感病材料苏御糯（Suyunuo）回交后再自交1-3代，利用开发的分子标记对1,150株BC2F2群体、1,456株BC2F3和5,769株BC2F4群体进行交换单株筛选，并对自交产生的纯合株系在孕穗期注射孢子悬浮液，进行穗瘟抗性鉴定，最终将区间锁定在JS57和JS4-5两个分子标记之间的16Kb区间内，该区间预测有4个候选基因。经过亲本间基因序列比对和结构域分析，最终将一个编码LRR蛋白的基因LOC_Os11g45600（ORF1）和一个编码CC-NBS蛋白的基因LOC_Os11g45620（ORF2）确定为候选基因。 （2）对具有700KSNP的232个自然群体材料（包含江南晚和苏御糯）的穗瘟抗性表型进行GWAS分析，在11号染色体末端SNP_26984329和SNP_28459253之间重复鉴定到一个1.47Mb的穗瘟抗性相关位点（PBRL10和PBRL18）。通过LD热图、多态性SNP分组、单倍型分析、表达分析和功能域分析，最终锁定LOC_Os11g45600为候选基因。 （3）克隆了两个候选基因，经测序比较发现，LOC_Os11g45600是LOC_Os11g45620编码区的一部分。LOC_Os11g45600与LOC_Os11g45620共同组成的基因命名为Pb-jnw1，Pb-jnw1编码的蛋白具有完整的CC-NBS-LRR结构域。在苏御糯中Pb-jnw1的等位基因发生单碱基替换，导致提前终止，缺失了526个氨基酸（58.92KDa），破坏了CC-NBS-LRR结构域的完整性。穗部诱导表达结果显示，Pb-jnw1受稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）Hoku1诱导表达。与野生型（WT）植株相比，互补或过量表达Pb-jnw1可以有效地降低水稻病粒率和病斑数目，但不影响病斑大小。融合GUS报告基因材料组织染色观察发现Pb-jnw1在孕穗期的谷粒中高表达。进化分析结果表明，Pb-jnw1与普通野生稻（Oryzarufipogon）中的等位基因遗传距离较短。 （4）对转基因材料进行农艺性状统计分析，发现敲除、互补和过量表达Pb-jnw1不影响水稻株高、分蘖数、结实率、千粒重和生育期等农艺性状。开发了与Pb-jnw1连锁的分子标记JS4-5，并利用MAS，将Pb-jnw1导入江苏省栽培品种宁稻1号、南粳9108、南粳44、武运粳7号和镇稻88中。通过田间病圃和室内接菌对这些材料进行抗性鉴定分析，发现其对苗瘟和穗瘟均具有较好的抗性，且不影响农艺性状。为利用MAS培育稻瘟病抗性品种提供资源。 2、OsNPSN11蛋白参与抗稻瘟病过程的机理研究 （1）OsNPSN11具有Qb-SNARE结构域和跨膜结构域。通过基因芯片公共数据预测分析，发现OsNPSN11在水稻全生育期均有较高的表达量。对接种稻瘟病菌Hoku1进行诱导表达分析，表明OsNPSN11在抗稻瘟病材料黑壳子粳（Heikezijing）中的表达量显著受Hoku1诱导，在48hpi达到峰值；而在感病材料苏御糯中，其表达量不受Hoku1诱导。 （2）对OsNPSN11转基因株系进行稻瘟病抗性鉴定，接种Hoku16d后，OsNPSN11过量表达的转基因株系S11-2和S11-4的平均病斑数目分别为11.4±2.3和16.5±3.1个，与WT相比显著性变少；干扰抑制表达的转基因株系A11-49和A11-72的平均病斑数目分别为60.3±7.5和58.9±6.8个，与S11-2、S11-4和WT相比显著性变多；过量表达的转基因株系和干扰抑制表达的转基因株系的病斑长度与WT相比均没有显著性差异。 （3）亚细胞定位结果显示，OsNPSN11主要定位在细胞质膜上。比较分析过量表达转基因株系与WT的蛋白质组学和基因芯片数据，结果显示，差异表达蛋白主要参与氮代谢、初级代谢、叶绿素的合成、有机物的运输、离子迁移和催化活性；差异表达基因中上调表达基因主要参与植物非生物逆境胁迫、过氧化氢分解、激素响应、解毒、抗氧化、植物-病原体相互作用和MAPK信号通路，下调表达基因主要参与氮代谢、自噬和二萜生物合成。进一步研究发现，干扰抑制表达的转基因株系的稻瘟病菌侵染点附近H2O2含量显著低于WT；对植物组织总H2O2含量进行测定，发现WT和A11-49的H2O2含量在接菌处理12h后显著升高，但两个过量表达转基因株系中的H2O2含量则是显著下降的，表明OsNPSN11促进ROS的清除和ROS在侵入点附近局部积累。 （4）为了研究OsNPSN11与ROS爆发之间的关系。通过LUC瞬时表达系统，验证了OsNPSN11与类受体胞质激酶OsRLCK118和OsRLCK185以及几丁质激发子结合蛋白OsCEBiP相互作用；通过qPCR分析表明，抑制OsNPSN11的表达，会促进OsRLCK118、OsRLCK185、OsrbohB、OsCEBiP和OsCERK1的表达，过量表达OsNPSN11对不影响这些基因的表达量。 以上研究结果表明，在病原菌侵染时，OsNPSN11促进H2O2在侵染点附近积累，同时激活ROS清除相关基因和病程相关蛋白基因的表达，抑制ROS爆发相关基因的表达。
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