摘要
苹果（Malusdomestica）是我国最重要的经济类农产品之一。我国已经成为世界最大苹果生产国，产量和种植面积均占世界的百分之五十以上。目前，全国大部分地区果园都出现了不同程度的病毒病危害，且大多为复合侵染，严重制约了我国苹果产业的健康持续发展。其中发生较重的潜隐性病毒有苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus,ACLSV）、苹果茎痘病毒（Applestempittingvirus,ASPV）、苹果茎沟病毒（Applestemgroovingvirus,ASGV）和苹果胶质木病毒-2（Applerubberywoodvirus-2,ARWV-2）等，非潜隐性病毒有苹果坏死花叶病毒（Applenecroticmosaicvirus,ApNMV）等。本研究针对高发病率的ASGV和ApNMV制备多克隆抗体，并以此为基础建立斑点酶联免疫吸附法（Dot-Enzyme-linkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA），为实现脱毒苗脱毒效果检测及田间ASGV和ApNMV的低成本、大规模检测提供技术支撑；同时，建立ASGV的多分离物侵染性克隆及ARWV-2的微型复制子体系，为将来在基因组水平上研究病毒的分子生物学特征、了解病毒与寄主相互作用机制、筛选抗病毒药剂等奠定基础。研究结果如下： 1.ASGV和ApNMV多克隆抗体制备及Dot-ELISA方法的建立 本研究利用山东省泰安市田间采集的苹果病样，通过RT-PCR技术扩增出病毒外壳蛋白的基因序列，以原核表达并纯化后的重组蛋白作为抗原，多次免疫兔子获得抗血清。通过间接酶联免疫吸附法（Indirect-Enzyme-linkedimmunosorbentassay,I-ELISA）测定ASGV抗血清效价为1∶4500，ApNMV为1∶2000，并利用Westernblot证明制备的抗血清都具有较好的特异性，ASGV可在抗体稀释1∶4000时使用，ApNMV可在1∶15000时使用。在此基础上，对田间采集的6个不同苹果品种病叶样品，分别用RT-PCR和Dot-ELISA方法检测，结果表明两种方法阳性检出率基本一致，说明本研究建立的Dot-ELISA方法对田间病样中ASGV和ApNMV的快速检测具有一定的应用价值。 2.ASGV的全基因组侵染性克隆构建 本研究利用RT-PCR扩增出ASGV全长基因组，通过同源重组法得到质粒pCB301-XF33，转化农杆菌接种心叶烟，结果发现该分离物侵染效率较差。为提高侵染率，从以下两方面着手：一是鉴定该病毒的基因沉默抑制子。利用共注射法鉴定发现ASGV编码的三个区域Rep、CP和MP均不是该病毒的基因沉默抑制子，因此我们在后期的试验中将ASGV侵染性克隆和病毒沉默抑制子P19在心叶烟中进行共浸润。二是克隆不同地区、品种的病毒全长分离物并构建侵染性克隆。不同的克隆序列不完全一致，会导致侵染性强弱的差异，因此通过酵母体内重组法得到另外7个ASGV的分离株及变异株，并将以上7个克隆与病毒沉默抑制子P19在心叶烟中共浸润发现侵染率均在67%以上，一部分地区ASGV构建的侵染性克隆侵染效率达到100%。 3.ARWV-2的微型复制子体系构建 ARWV-2为分节段负义RNA病毒，共有三个基因节段（L,M,S），在进化中极为特殊，且目前还没有任何果树上分节段负义RNA病毒的侵染体系报道。本实验利用报告基因eGFP替换ARWV-2S基因组的N基因，将其与HH和HDV-RZ核酶融合于35S启动子驱动表达的pCB301载体上，构建了ARWV-2基于S基因组的微型复制子体系。通过各组分不同克隆的排列组合、排除假阳性的方法筛选到了具有微弱功能的野生型RdRp，并通过大量测试，包括调整RdRp、N的浓度、加入移动蛋白NSm等手段进一步优化该体系，为将来能够从全长基因组cDNA中拯救出具有活性的负链多分体RNA病毒ARWV-2奠定基础。
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