摘要
普鲁兰多糖作为一种新型的生物基高分子材料，在许多领域都有着广泛的应用前景。目前，生产过程的高成本是制约普鲁兰多糖大规模应用的重要因素。所以，开发出一套成本低廉且高产量的普鲁兰多糖发酵生产工艺以推动普鲁兰多糖的市场经济具有重要的意义。 本文以出芽短梗霉（AureobasidiumpullulanCGMCCNO.7055）作为出发菌株，研究以麦芽糊精作为碳源发酵生成普鲁兰多糖的生产工艺。首先，研究了以麦芽糊精为碳源发酵普鲁兰多糖的快速检测方法。其次，通过响应面试验设计、正交试验设计与人工神经网络和遗传算法相结合，对普鲁兰多糖发酵的种子和发酵培养基与培养条件进行优化。最后，通过非靶向代谢组学的方法对不同温度条件下出芽短梗霉发酵过程中的胞内代谢物进行分析，为普鲁兰多糖合成机理的研究提供启示。主要内容如下： （1）开发了以麦芽糊精为底物发酵生产普鲁兰多糖的快速检测方法。首先，在1.2mol/LHCL、沸水浴3min条件下，底物麦芽糊精发生水解。其次，在2.4mol/LHCL、沸水浴30min条件下，底物与普鲁兰多糖一同发生水解。通过两者的差值计算普鲁兰多糖的产量。与醇沉法相比，快速检测方法的测定结果更加接近液相法。 （2）通过单因素试验、响应面试验设计、人工神经网络建模寻优的方法对种子培养基和初始pH进行了优化。得到的结果为（g/L）：麦芽糊精40.0、NaCl1.0、酵母抽提物6.9、K2HPO41.2、MgSO4·7H2O0.3，pH5.5。 （3）通过单因素试验、正交试验设计、人工神经网络建模寻优的方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。得到的结果为（g/L）：麦芽糊精138.8、酵母抽提物4.9、NaCl5.8、MgSO4·7H2O1.5、K2HPO47.0，pH6.0、种龄18-20h、接种量为3%（v/v）。普鲁兰多糖的产量为78.04g/L，基质成本较葡萄糖培养基降低了约18.12%。 （4）在5L发酵罐水平上，研究了温度对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的影响。发现温度在32℃时，普鲁兰多糖的产量达到最高为53.41g/L。 （5）基于LC-MS技术，研究了不同温度条件下出芽短梗霉产普鲁兰多糖发酵过程中胞内代谢物的变化情况。同时，进行了普鲁兰多糖相关合成与降解酶活的测定。发现在正负离子模式下，分别鉴定到1248与823个代谢物。通过KEGG通路富集分析，在设定条件下检出13条代谢通路以及56个差异代谢物。根据检出的差异代谢物与合成普鲁兰多糖相关代谢途径结合分析，发现在试验组中加强了出芽短梗霉发酵过程中的TCA循环、嘌呤代谢途径，降低了鸟氨酸代谢、苯丙氨酸与色氨酸代谢以及磷酸戊糖途径。酶活测定结果显示，试验组相比对照组，普鲁兰多糖的三种关键合成酶活均得到了提高。
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