摘要
梨（Pyrus）是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果，我国梨产业分布面积广，产量也位居世界第一。然而梨的生长发育会遭受不利地理条件和气候环境的制约和影响。在梨的生产栽培过程中常遭受干旱、冷害、冻害和土壤盐渍化的危害，其中土壤盐渍化导致的盐胁迫的危害十分严重。目前利用现代分子生物学技术挖掘耐盐相关基因进而培育梨抗盐新品种已经成为应对盐胁迫的重要方法和策略。bHLH转录因子在其他物种中对于耐盐性的提高已经有了广泛研究，但在梨中的研究仍然较少。 多项研究表明杜梨（PyrusbetulifoliaBunge）是优异的抗盐碱砧木资源，因此本研究选用杜梨作为实验材料，课题组前期通过分析盐转录组数据得到PbebHLH53基因积极响应盐胁迫。基于此以杜梨的cDNA为模板，克隆出耐盐基因PbebHLH53，首先将PbebHLH53基因异源转化拟南芥并在杜梨中进行PbebHLH53基因沉默（VIGS），研究其在盐胁迫下的功能，其次通过酵母双杂交文库筛选获得与其互作蛋白PbrbZIP20，在白梨（Pyrusbretschneideri）中对bZIP基因家族进行家族鉴定以获取更多潜在的耐盐基因和其他与PbebHLH53蛋白互作的bZIP蛋白并做了基因表达分析，主要结果如下： 1、PbebHLH53在盐、干旱、低温胁迫处理下表达量均会发生显著变化，该基因定位表达于细胞核。在拟南芥中过表达PbebHLH53基因提高了植物的耐盐性：与野生型相比，转基因拟南芥幼苗在盐板上的发芽率更高，根长更长，且均有显著性差异。转基因盆栽拟南芥在100mM浓度的NaCl处理下生长更加良好、光合速率更高、细胞膜损伤程度更低。同时组织染色和ROS测定结果表明超表达系ROS积累较少，说明超表达系在盐胁迫条件下具有更强的ROS清除能力。转基因拟南芥在盐胁迫下拥有更高的钠钾比和抗坏血酸含量。以上结果表明PbebHLH53可能通过平衡植物体内离子平衡、增强活性氧的清除能力、增加抗坏血酸含量来提高耐盐性。PbebHLH53基因在被沉默抑制表达后，杜梨对于盐胁迫的耐受性显著降低，进一步说明了PbebHLH53基因在提高耐盐性中具有重要作用。 2、酵母双杂交实验和萤火虫荧光素酶片段互补成像（LCI）实验验证了PbebHLH53与PbrbZIP20之间的蛋白质互作关系。经过全基因组鉴定共筛查鉴定得到92个PbrbZIP基因，这些基因被分为14个亚组。其中83个基因随机分布在4号染色体以外的17条染色体的不同位置上，其余9个基因分布在染色体支架上。全基因组复制和纯化选择促使PbrbZIP家族发生基因发生了扩张。最后对PbrbZIP基因进行了表达分析，结果表明PbrbZIP20能够积极响应多种逆境胁迫且与PbebHLH53基因正向协同响应盐胁迫，通过基因的表达分析发现梨bZIP基因家族中PbrbZIP16、PbrbZIP23、PbrbZIP51和PbrbZIP89基因参与盐胁迫的响应。 以上结果为进一步研究PbebHLH53基因的耐盐机理奠定了基础，为挖掘梨中潜在的耐盐基因提供依据，为通过基因工程培育耐盐碱品种做出了重要贡献。
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