摘要
肥胖近些年已经成为主要的公共健康问题之一。肥胖的发生发展过程受到很多因素的影响，先天固有免疫系统、获得性免疫系统和肠道菌群共同在肥胖的发展过程中起到重要的调节作用。Toll 样受体9（Toll like receptor 9, TLR9）是先天固有免疫TLRs （Toll like receptors）组成之一，它识别来自细菌、病毒和宿主自身DNA的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）DNA。 B细胞是获得性免疫系统的重要组成部分，表达大量的TLR9。肠道免疫细胞和上皮细胞与肠道微生物群不断相互作用，TLR9在粘膜免疫稳态中起着重要作用，可以调节肠道菌群的组成和功能。B 细胞同时也可以通过产生抗菌肽以及免疫球蛋白等来调控肠道中特定的细菌生长。目前，B细胞上TLR9对于机体免疫系统的影响，对肠道菌群的调节以及对肥胖的发生发展过程的作用暂不清楚。 研究目的： 观察对比B细胞Tlr9特异性敲除小鼠及非敲除小鼠体重增长及肥胖情况，对比免疫细胞功能的变化，分析肠道菌群的变化及作用，进而探索B细胞上Tlr9特异性缺乏是通过何种机制调节肥胖的发生发展，从而为肥胖的治疗和预防提供新的思路。 研究方法： （1）本研究首先建立了B 细胞上Tlr9特异性敲除小鼠模型，将Tlr9fl/fl和 Cd19Cre+B6小鼠相互交配去获得B细胞上Tlr9特异性敲除（Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/-）B6小鼠和对照组（Tlr9fl/fl/Cd19Cre-/-）B6小鼠。给予高脂饮食观察该基因型小鼠的体重增长肥胖情况，同时进行糖耐量实验及胰岛素抵抗实验，来分析对比B细胞上Tlr9特异性敲除对糖代谢能力及胰岛素抵抗的影响。 （2）本研究探究B细胞上Tlr9特异性敲除对免疫细胞的影响，分析对比18到22周高脂饮食饲养的敲除小鼠和非敲除小鼠免疫淋巴细胞的分群及功能差异，深入探究免疫细胞差异所带来的对于肥胖发生发展的影响。在免疫细胞功能差异的基础上，将免疫细胞静脉注射给免疫缺陷 Rag1-/- B6 小鼠，进一步更特异性的观察免疫细胞的作用。 （3）在确立B细胞上Tlr9缺乏对肥胖的作用的基础上，本研究进一步探索B细胞上 Tlr9 敲除对小鼠肠道菌群的影响，通过 16S rRNA 测序技术分析对比Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠及对照组小鼠肠道菌群的组成，并且通过将粪便菌群移植至无菌B6老鼠来观察肠道菌群对免疫细胞功能及肥胖发生发展的影响。 （4）对于B细胞上特异性敲除Tlr9所带来的免疫细胞变化以及对肥胖发生发展的影响，我们对纯化的B细胞进行RNA测序技术分析B细胞上基因差异，以探究Tlr9在B细胞上特异性敲除的内部分子机制。 研究结果： （1）我们观察了Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠及Tlr9fl/fl/Cd19Cre-/- B6 小鼠的体重增长情况。通过给予高脂饮食，我们发现B细胞上Tlr9特异性敲除有更高的体重及体重增长，更差的糖代谢能力并出现胰岛素抵抗，证明了B细胞上Tlr9缺乏会导致肥胖。 （2）通过应用流式细胞技术对淋巴细胞表面抗原及细胞内因子进行抗体染色分析，发现在 Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠中，肥胖伴随着产生 IL-10 的 B 细胞减少，有趣的是，我们还发现 B 细胞中 Tlr9 的缺乏会影响 B 细胞的分化，同时伴随着 CD4+ T 细胞，CD8+ T 细胞及T 细胞亚群TFH（CXCR5+PD-1+CD4+）、TPH（CXCR5- PD-1+CD4+）的变化。 （3）通过淋巴细胞体外增殖实验，发现B细胞特异性缺乏Tlr9会改变B细胞和T细胞的反应及功能，并伴随着 IL-10 的水平变化。通过过继性输注淋巴细胞至 Rag1-/-B6小鼠体内，我们发现免疫细胞可以传递原生小鼠的肥胖现象，并且影响糖代谢能力及胰岛素抵抗。证明了在建立的小鼠模型上，免疫细胞会影响肥胖的发生发展。 （4）通过对淋巴组织流式细胞染色分析，我们发现在Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠中，淋巴组织炎症浸润更重，尤其在肠道淋巴结 Peyer’s Patch 派尔集合淋巴结中。通过对脂肪组织流式细胞染色及qPCR分析，Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6小鼠的细胞因子浸润更重，细胞因子的表达量更高。证明了在Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠中，肠道淋巴结及脂肪组织的炎症反应更重。 （5）通过检测肠道内容物上清液中的免疫球蛋白，发现B细胞上特异性缺乏Tlr9会导致肠道内容物中免疫球蛋白发生明显变化。进一步通过 16S rRNA 测序技术检测Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠和对照组Tlr9fl/fl/Cd19Cre-/- B6 小鼠的肠道菌群组成，发现两种小鼠的微生物群组成以厚壁菌门和拟杆菌门成员为主，拟杆菌门的比率在Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠中显着升高。 （6）通过将Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠及Tlr9fl/fl/Cd19Cre-/- B6 小鼠的肠道菌群移植到无菌B6小鼠体内，观察不同肠道菌对受体小鼠的免疫细胞的影响，对糖代谢影响以及对体重增长的影响。我们发现不同肠道菌群确实会影响免疫细胞，同时Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 肠道菌群受体小鼠表现出了更差的糖代谢能力以及更高的体重增长率。同时，对 Rag1-/-无菌 B6 小鼠进行过继性细胞输注及肠道菌群移植实验，发现Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠的肠道菌的两种免疫细胞受体小鼠表现出更明显的糖代谢差异，证明了肠道菌群的必要性。 （7）通过对纯化的 B 细胞进行 RNA 测序分析，发现在 Tlr9fl/fl/Cd19Cre+/- B6 小鼠中， Irf4 是明显下降的基因之一。通过体内实验及体外实验验证，我们发现，Irf4 可能深度参与了TLR9对B细胞的调节，并且直接影响了IL-10的水平，加重了机体的炎症状态。 研究结论： （1）B细胞上的Tlr9在肥胖的发生发展过程中起到保护作用； （2）B细胞上的Tlr9特异性缺乏影响B细胞分化及T细胞的亚群； （3）B细胞上的Tlr9特异性缺乏影响免疫细胞反应和功能； （4） B细胞上的Tlr9特异性缺乏影响了机体的炎症状态，加重了机体的炎症反应，突出表现在肠道淋巴结及脂肪组织中； （5）B细胞上的Tlr9特异性缺乏影响肠道内免疫球蛋白的产生，改变肠道菌群的组成，影响了肠道菌群的细菌组成比例； （6）B细胞上的Tlr9特异性缺乏小鼠的肠道菌群可以影响受体小鼠的免疫系统，并且传递糖代谢及肥胖相关表型； （7）B细胞上的Tlr9可能是通过Irf4来调节免疫，加重机体炎症反应，导致肥胖。
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