摘要
种子萌发过程是植物开始其生命周期的第一阶段，也是至关重要的阶段，种子的正常萌发关乎植物的正常繁衍、进化和农业生产。在复杂的环境胁迫下，植物种子难以正常萌发与成苗。因此，对于种子萌发相关基因的研究具有重要意义。TALE、GRAS和 WRKY 转录因子被报道参与种子萌发的调控以及对环境胁迫的响应，基于本实验室转录组测序结果和相关文献报道，筛选到大豆种子萌发候选基因 GmTALE9、GmGRAS36 和 GmWRKY15，为探究它们在大豆种子萌发中的作用，本文对三个候选基因GmTALE9、GmGRAS36和GmWRKY15进行生物信息学分析、基因克隆和相关功能研究。获得主要结果如下： 1.生物信息学分析显示 GmTALE9 基因具有调节植物生长发育的 HOX 结构域， GmTALE9 蛋白与栽培大豆、野生大豆的 BEL1-like 亚家族蛋白具有较高的同源性。亚细胞定位结果显示，GmTALE9基因编码的蛋白质定位于细胞核中。GUS组织化学染色分析显示，GUS蛋白在GmTALE9Pro-GUS转基因拟南芥的根、茎、叶和花中均有表达。转录自激活实验结果显示GmTALE9蛋白具有转录自激活活性。转基因拟南芥功能研究发现，与对照野生型（Wild type，WT）相比，GmTALE9 过表达转基因拟南芥的角果长度和籽粒长度变短，千粒重下降，地上部干重和鲜重增加。在盐胁迫下，与对照 WT 相比，GmTALE9 过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，抽薹提前，莲座丛变大，主根长、地上部干重和鲜重增加；活性氧染色发现，GmTALE9过表达转基因拟南芥中积累的H2O2和O2-减少；大豆毛状根遗传转化实验结果显示，与对照空载植株相比，GmTALE9过表达转基因复合大豆植株的毛状根的总根长增加，根尖数、侧根数增多，毛状根干重和鲜重增加。在干旱胁迫下，与对照WT相比，GmTALE9过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，主根长增加。在ABA、ABA和GA4+7共同处理下，与对照 WT 相比，GmTALE9 过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高。综合以上结果推测GmTALE9基因可能在大豆种子萌发及耐盐耐旱调控网络中发挥正向作用。 2.生物信息学分析显示 GmGRAS36 基因具有 GRAS 家族的典型功能结构域， GmGRAS36蛋白与野生大豆的GRAS13蛋白具有较高的同源性。亚细胞定位结果显示，GmGRAS36 基因编码的蛋白质定位于细胞核中。GUS 组织化学染色分析显示，GUS 蛋白在 GmGRAS36Pro-GUS 转基因拟南芥的根和叶中表达。转录自激活结果显示GmGRAS36蛋白具有转录自激活活性。酵母单杂交实验结果表明，GmWRKY15基因和GmGRAS36启动子之间存在互作。转基因拟南芥功能研究发现，与对照 WT相比，GmGRAS36过表达转基因拟南芥的角果长度和籽粒长度变短，千粒重下降。在盐胁迫下，与对照WT相比，GmGRAS36过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，莲座丛变大，主根长、地上部干重和鲜重增加；活性氧染色发现，GmGRAS36过表达转基因拟南芥中积累的H2O2和O2-减少；大豆毛状根遗传转化实验结果显示，与对照空载植株相比，GmGRAS36-Cas9转基因复合大豆植株的毛状根的总根长降低，根尖数、侧根数减少，毛状根干重和鲜重降低。在干旱胁迫下，与对照WT相比，GmGRAS36过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，主根长增加。在ABA、ABA和GA4+7共同处理下，与对照WT相比，GmGRAS36过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高。综合以上结果推测 GmGRAS36 基因可能在大豆种子萌发及耐盐耐旱调控网络中发挥正向作用。 3.生物信息学分析显示 GmWRKY15 基因具有两个 WRKY 保守结构域， GmWRKY15蛋白与野生大豆、豇豆的WRKY24蛋白具有较高的同源性。亚细胞定位结果显示，GmWRKY15 基因编码的蛋白质定位于细胞核中。GUS 组织化学染色分析显示，GUS蛋白在GmWRKY15Pro-GUS转基因拟南芥的根、叶和花中表达。转录自激活实验结果显示GmWRKY15蛋白具有转录自激活活性。转基因拟南芥功能研究发现，与对照WT相比，GmWRKY15过表达转基因拟南芥的角果长度和籽粒长度变短，千粒重下降。在盐胁迫下，与对照WT相比，GmWRKY15过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，莲座丛变大，主根长、地上部干重和鲜重增加；活性氧染色发现， GmWRKY15 过表达转基因拟南芥中积累的 H2O2和 O2-减少。在干旱胁迫下，与对照WT相比，GmWRKY15过表达转基因拟南芥的种子萌发率提高，主根长增加。综合以上结果推测 GmWRKY15 基因可能在大豆种子萌发及耐盐耐旱调控网络中发挥正向作用。
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