摘要
7-羟基-去氢表雄酮具有增强机体免疫功能、促进减肥的功效，同时对癌症和阿尔茨海默症有一定疗效。化学合成法合成7-羟基-去氢表雄酮步骤繁琐，成本高，并产生有毒有害衍生物质；基于丝状真菌的微生物转化法通过一步反应能够在去氢表雄酮（DHEA）的C7位引入羟基，但已报道丝状真菌存在羟化特异性差、转化率低等问题，无法用于工业生产。本论文的研究目的是筛选鉴定对底物DHEA具有高C7β-羟化活性和特异性的CYP5311B2突变体，并将构建的重组菌用于DHEA 的高效C7β-羟基化反应。 本课题以来源于蓝色犁头霉的甾体C11-β羟化酶CYP5311B2为研究对象，构建羟化酶CYP5311B2的重组酿酒酵母表达平台，发现CYP5311B2对DHEA具有明显的C7β-羟化活性。为了进一步提高CYP5311B2对DHEA的C7β-羟化活性和特异性，利用课题组前期已构建的表达羟化酶CYP5311B2突变体库的33个重组酿酒酵母菌株，筛选和鉴定影响DHEA的C7β-羟化活性及羟化特异性的关键氨基酸位点。结果表明，突变体Y398F、F147A、V309I、D290E/V309I/Y398F的DHEA C7β-羟化特异性明显提高，其中Y398F重组突变体的7β-OH-DHEA产率为CYP5311B2野生型的2倍。在以上研究基础上，进一步构建了16个定点突变体，其中突变体D290V、S367G显示明显增加的DHEA C7β-羟化特异性。D290V的7β-OH-DHEA产率为野生型羟化酶CYP5311B2的4倍。最后，为获得适合于羟化酶CYP5311B2表达的黑曲霉宿主，敲除了黑曲霉内源C11α-羟化酶基因CYP5061，获得了黑曲霉转化DHEA本底影响明显降低的重组黑曲霉。 突变体D290V的鉴定为进一步研究和解析甾体羟化酶CYP5311B2的DHEA C7β-羟化机制提供了重要的材料和基础数据，从而为下一步设计和构建具有工业应用价值的理想DHEA C7β-羟化活性和特异性的CYP5311B2突变体以及相应的高效生产菌株奠定了良好基础。
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