摘要
随着生物技术的不断发展和应用，微生物发酵技术已成为许多产业的主流趋势，其中包括食品、医药、化妆品等行业。莽草酸（Shikimic Acid，SA）作为一种重要的有机酸，具有广泛的应用前景，包括抗病毒、抗氧化、保健和化妆品等领域。传统的SA 生产方法通常采用化学合成，然而，这种方法不仅成本高昂，还存在环境污染和产品纯度低等问题。因此，越来越多的研究者开始利用微生物发酵技术生产 SA。微生物发酵技术具有生产成本低、产品纯度高、环境友好等优势，在现代工业生产中越来越受到重视。 本研究对Escherichia coli（E. coli）中心碳代谢进行重新分配。为强化前体物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的供应，通过敲除ptsG基因并强化galP基因改造糖摄取系统来降低PEP的消耗；通过强化tktA基因来提高E4P的供给。经过上述两步基因编辑操作，实现SA合成所需的前体物的供应。然后通过优化aroG基因来增强SA通路的碳通量。使用aroD基因和aroE基因的共表达模式并通过拟南芥中的连接器进行连接，以减少3-脱氢莽草酸（DHS）的积累，使其较改造前降低了76.3%，同时提高了 SA的滴度。在大肠杆菌发酵 SA时，通常会阻断其下游代谢，并在培养基中添加L-苯丙氨酸（L-Phe）、L-酪氨酸（L-Tyr）和L-色氨酸（L-Trp），使菌株正常生长。但添加的三种芳香族氨基酸价格昂贵，导致 SA发酵成本较高。因此，为了降低发酵成本，优化SA的发酵性能，本研究通过敲除aroL基因，并通过aroKM13A突变体来弱化SA的下游代谢，以此维持菌株的正常生长并提高了SA的积累至44.8 g/L。最后引入Quorum感应系统，通过菌体密度调整自诱导剂3OC6-HSL（AHL）的浓度，从而激活或抑制基因的表达。esaI 基因所表达的酰基合酶可催化 AHL 的生成，因此我们测试了三种启动子来控制 esaI 基因的表达。测试后发现，在启动子 PL24的控制下，该系统的响应值和灵敏度最好。因此我们利用该系统控制TCA循环和SA途径的碳通量并优化发酵条件。最后，在不添加昂贵芳香族氨基酸和SA下游代谢产物的基础上，菌株dSA10 在5-L发酵罐中发酵64 h, SA 产量为60.31 g/L，转化率为30.1%，副产物DHS 为15 g/L。
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