摘要
乳腺炎是一种复杂的多诱因疾病，细菌感染是主要原因。乳腺炎症对血乳屏障完整性的破坏会影响泌乳功能。牛磺酸是一种天然的生理免疫调节剂，具有抗炎、抗氧化和调节代谢等功能。本课题组前期研究表明，牛磺酸能够缓解乳房链球菌感染诱导的模型动物乳腺炎症及乳腺上皮细胞炎性损伤，这提示其在奶牛乳腺炎防控中具有应用潜力。基于此，本课题探究了牛磺酸对泌乳奶牛生产性能、血液指标和乳腺炎患病情况的影响，及牛磺酸对乳房链球菌感染后乳腺血乳屏障的保护作用及相关机制。研究的开展为牛磺酸在奶牛健康养殖中的应用提供了科学依据和理论支持，并为乳房链球菌及其它细菌性乳腺炎的防控提供新的思路和方法。具体研究内容及结果如下： 1. 牛磺酸对泌乳奶牛生产性能、血液指标和隐性乳腺炎患病率的影响 为探究牛磺酸对泌乳奶牛生产性能、血液指标和隐性乳腺炎患病率的影响，本试验选取32头健康的泌乳初期荷斯坦奶牛，并随机分为4组，每组8头，分别为对照组和每天 30 g/头（低）、60 g/头（中）、90 g/头（高）牛磺酸添加组，饲喂 60 天。在试验第 15、30、45、60 天采集奶样进行乳成分分析，并记录产奶量和乳腺炎患病情况，在第30和60天采集静脉血测定血常规、血清生化指标和抗氧化指标。结果显示：对照组奶牛试验期间隐性乳腺炎患病率为 37.5%（3/8），60 和 90 g/头牛磺酸添加组隐性乳腺炎患病率均下降至 12.5%（1/8）；与对照组相比，60 g/头牛磺酸添加组奶牛乳体细胞数（SCC）以及血清中β-HB、非酯化脂肪酸（NEFA）和丙二醛（MDA）含量显著减少，而血液淋巴细胞（Lym）数量、血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高（P＜0.05）；90 g/头牛磺酸添加组奶牛 SCC 以及血清中 β-HB、NEFA 和MDA含量显著下降，而血液Lym数量、血红蛋白和红细胞压积、TP、GLB、T-AOC、GSH水平和SOD活性显著上升（P＜0.05）；另外，牛磺酸补充组产奶量均有一定程度上升。结果表明，饲料中添加牛磺酸能够改善泌乳奶牛免疫力、调节机体代谢平衡和抗氧化作用，从而减少隐性乳腺炎的发生，降低泌乳奶牛的乳体细胞数。 2. 牛磺酸对乳房链球菌感染小鼠乳腺血乳屏障的影响 血乳屏障的完整性与乳腺健康密切相关，感染引起的炎症反应对血乳屏障具有破坏作用。为了探究牛磺酸对乳房链球菌（S. uberis 0140J）诱发小鼠乳腺炎时血乳屏障的影响，本试验以 C57BL/6 小鼠为研究对象，在怀孕 14 天后每天灌胃 200 mg/kg 牛磺酸或相应体积的无菌生理盐水。雌鼠分娩后 48 h，在第四对乳头灌注 S. uberis（S. uberis、S. uberis+Taurine 组）或相应体积的无菌生理盐水（Control、Taurine 组），24 h 后收集乳腺组织。通过病理组织切片、荧光定量 PCR、Western blot 和免疫荧光切片等技术观察或检测乳腺炎症反应、氧化应激、NF-κB 和 MAPK 信号通路以及血乳屏障通透性相关指标。结果显示：牛磺酸能够缓解 S. uberis 感染导致的小鼠乳腺充血、水肿，以及乳腺组织的炎性细胞浸润和局部坏死。牛磺酸遏制感染引起的髓过氧化物酶（MPO）蛋白表达和活性上升、MDA水平上升及 T-AOC 和 GSH 水平下降（P＜0.05）。同时，牛磺酸抑制了感染诱导的促炎性介质TNF-α、IL-1β、IL-6、NOS2、COX2和趋化因子CXCL1、CXCL2的mRNA表达水平上升，以及IκB、p65、p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化（P＜0.05）。此外，牛磺酸还减少了乳腺腺泡中的FITC-白蛋白含量和中性粒细胞密度（ P＜0.05 ），并阻止了感染引起的紧密连接蛋白 claudin3 和occludin水平下降（P＜0.05）。而且进一步分析发现，乳腺腺泡中的FITC-白蛋白含量与中性粒细胞密度呈正相关（P＜0.05）。结果表明，牛磺酸能够通过调节 NF-κB 和MAPK 信号通路抑制 S. uberis 感染引起的乳腺炎症反应和氧化应激，并维护血乳屏障和紧密连接的完整性。 3. 乳房链球菌感染对巨噬细胞诱导中性粒细胞驱化的影响及牛磺酸的调控作用 中性粒细胞是炎症反应的主要参与者，其在乳腺中的募集会影响血乳屏障的完整性和乳腺炎的发展进程。为了探究牛磺酸对乳腺细胞诱导中性粒细胞趋化的影响及作用机制，本研究以小鼠乳腺上皮细胞系（ EpH4-Ev 细胞）、小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7 细胞）和中性粒细胞为研究对象，使用 S. uberis 感染后，结合牛磺酸、BAY 11-70825（NF-κB抑制剂）、Losmapimod（p38 抑制剂）、SCH772945（ERK 抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）或NG25（TAK1抑制剂）等进行相应处理，通过Transwell趋化模型、荧光定量PCR、western blot、流式细胞术等技术方法观察或测定相关指标。试验结果显示：S. uberis 感染诱导巨噬细胞CXCL2 的 mRNA表达上升幅度远高于乳腺上皮细胞（P＜0.05）；CXCL2 中和抗体显著抑制了 S. uberis/巨噬细胞共培养上清诱导的中性粒细胞迁移、F-actin活化以及p38、ERK和AKT蛋白磷酸化（P＜0.05），说明 S. uberis 感染导致的巨噬细胞 CXCL2 表达上升驱动了中性粒细胞的趋化作用。牛磺酸预处理能够显著抑制 S. uberis 感染导致的巨噬细胞趋化因子 CXCL2 的 mRNA和蛋白表达水平上升（P＜0.05）。BAY 11-70825、Losmapimod、SCH772945 或 SP600125预处理使CXCL2的mRNA表达显著下降（P＜0.05），而牛磺酸能够显著抑制p65以及p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化（P＜0.05）。TLR2封闭抗体处理显著降低了感染中p65、p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。牛磺酸能够抑制TAK1的活化（P＜0.05），NG25对IKK、IκB、p65、p38、ERK和JNK蛋白磷酸化的抑制效果与牛磺酸相似（P＜0.05）。结果表明，牛磺酸能够通过抑制TAK1活化调节其下游NF-κB与MAPK信号，降低感染中巨噬细胞CXCL2的表达，进而减少中性粒细胞的趋化。 4. 牛磺酸对乳房链球菌诱导的中性粒细胞胞外诱捕网释放的影响 中性粒细胞在抵达乳腺感染部位后会活化并释放胞外诱捕网（NETs）。NETs是宿主感染防御系统的双刃剑，对乳腺上皮细胞具有损害作用。为了探究 S. uberis 诱导中性粒细胞释放NETs的机制及牛磺酸的作用，本试验以中性粒细胞为研究对象，在S. uberis感染后利用牛磺酸、NAC（ROS清除剂）、mitoTEMPO（线粒体ROS清除剂）、DPI（NADPH氧化酶抑制剂）、TLR2封闭抗体、Losmapimod（p38抑制剂）、SCH772945 （ERK 抑制剂）或 SP600125（JNK抑制剂）进行相应处理，通过 SYTOX GREEN 染色、荧光酶标仪、流式细胞术和 Western blot 检测相关指标。结果显示：S. uberis 感染2 h 后导致中性粒细胞 NETs 释放量显著上升（P＜0.05）。 5. 牛磺酸对次氯酸诱导的乳腺上皮细胞和屏障损伤的影响 中性粒细胞受 S. uberis 刺激后会产生大量活性氧从而导致氧化应激。次氯酸（HClO）是中性粒细胞MPO-卤化物系统的主要活性氧产物，其强氧化能力是造成组织损伤的重要因素之一。为了探究HClO刺激下牛磺酸对乳腺上皮细胞的保护作用及相关机制，本试验以小鼠乳腺上皮细胞系（EpH4-Ev细胞）为研究对象，经HClO刺激以及牛磺酸、Compound C（AMPK 抑制剂）或 ML385（Nrf2 抑制剂）预处理后，通过CCK8 检测细胞活性、试剂盒检测上清 LDH 和细胞 MDA水平，Western blot 检测AMPK蛋白磷酸化水平以及抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1与紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin3的表达水平，利用Transwell构建乳腺上皮屏障并使用荧光酶标仪检测FITC-葡聚糖的通透性。结果显示：与对照组相比，200 μM 以上的 HClO导致乳腺上皮细胞活力显著下降，上清LDH活性及细胞MDA中水平显著上升（P＜0.05）。与HClO处理组相比，牛磺酸预处理均显著减少了细胞上清中LDH的活性和细胞中MDA水平（P＜0.05）。 综上所述，补充牛磺酸能够调节泌乳奶牛免疫力和代谢平衡并提高宿主抗氧化能力，减少SCC和隐性乳腺炎发病率。牛磺酸可以通过抑制巨噬细胞诱导的中性粒细胞趋化，减少中性粒细胞ROS和NETs产生，并激活乳腺上皮细胞AMPK/Nrf2抗氧化信号缓解S. uberis 感染导致的炎症反应和氧化应激，从而维护血乳屏障和紧密连接完整性。研究提示，牛磺酸在奶牛临床有很好的应用潜力。
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