摘要
烟酰胺单核苷酸（NMN）是人体辅酶ⅠNAD+的重要前体，直接参与NAD+的合成，与生物体内多种生化反应、免疫代谢调控息息相关。多项研究发现，NMN在缓解老年退行性疾病、神经退行性疾病、代谢紊乱和衰老等方面具有较好的作用。此外，NMN具有较高的食品安全性，日本、欧美等国家已经批准其作为新食品原料。与NAD+相比，NMN更容易进入细胞，因此适合在食品、饮料、保健品中使用，这也使得NMN产品的市场需求逐年上升，商业化前景较好。为了实现大肠杆菌发酵生产NMN，本研究设计了模块化代谢改造策略。 首先，对底盘细胞中烟酰胺（NAM）和产物的降解途径进行分析，对涉及的8个酶进行了失活，减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗。实验结果表明，大肠杆菌中NMN向烟酰胺核糖（NR）的转化是最主要的降解途径，经改造后工程菌E.coli N8对NMN消耗仅为4.57%。 其次，向E.coli N8中引入外源的转运蛋白NiaP和PnuC、强化内源的PRPP合成酶PrsA，同时缺失调节蛋白PurR，使工程菌E.coli N12具有转运NAM和NMN以及积累前体PRPP的能力。质粒过表达Chitinophaga pinensis来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt后，工程菌E.coli N12’摇瓶发酵可积累0.34g/L的NMN。 然后，对E.coli N12进行代谢改造实现了NAM为前体发酵生产NMN。筛选比较确定了Comamonadaceae bacterium来源的Nampt酶活性较高且对底盘细胞负担较小。通过质粒表达进一步强化CbNampt、PnuC和PrsA的表达水平，工程菌E.coli N18摇瓶发酵NMN产量提高至1.36g/L。5L发酵罐分批补料发酵38h，NMN产量达到10.2g/L，NAM到NMN的摩尔转化率为74.5%。 最后，对E.coli N12进行代谢改造实现以烟酸（NA）为前体发酵生产NMN。筛选比较确定了Francisella tularensis来源的NAD合成酶NadE能够催化烟酸核糖核苷酸（NaMN）合成NMN且酶活性较高。通过质粒表达Bacillus subtilis来源的烟酸磷酸核糖转移酶PncB和FtNadE后，工程菌E.coli N20摇瓶发酵可积累0.67g/L的NMN。5L发酵罐分批补料发酵38h，NMN产量达到3.1g/L，NA到NMN的摩尔转化率为81.6%。 本研究在大肠杆菌内探究了不同的NMN合成代谢途径，构建的NMN发酵生产菌株具有遗传背景清晰、无营养缺陷、无需诱导等优势，在5L发酵罐中实现了以不同前体发酵生产NMN，具有较好的工业应用前景。
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