摘要
睡莲（Nymphaea）是多年生浮叶型水生观赏植物。种苗生产是当前睡莲主要的产业形式，其传统育苗方式繁殖系数较低，劳动成本高。组织培养技术可在短时间内获得大量优质种苗，并可保持品种的优良性状，同时也是珍稀濒危植物进行离体保存较适合的方法。针对不同睡莲种子大小、内生菌量不同无法用统一的种子表面灭菌方法的问题，本研究以极濒危原生种海南延药睡莲为热带睡莲的代表，以远缘杂交亲本‘曼拉’为耐寒睡莲的代表，分别研究了其种子最适表面灭菌方法。针对睡莲种子无菌培养时发芽率低、无菌苗生长势较弱的问题，本研究筛选出提高种子萌发率的最佳培养基质和促进无菌苗生长的最佳生长调节剂配方。我们发现对睡莲块茎进行无菌培养时其萌发速度快、发芽率高，但褐化现象较为严重，为此，以8个耐寒睡莲品种块茎为试材，探究了最适合离体培养的块茎类型及品种，揭示了睡莲组培褐化与生理指标的相关性，并筛选出最佳的抑制褐化方法。针对目前睡莲再生体系尚未建立、严重限制转基因育种进程的问题，以耐寒睡莲成熟胚为试材，筛选出愈伤组织诱导及增殖培养基的配方，并进一步探究了外植体内源生长调节剂与诱导率的关系，为睡莲再生体系的建立奠定基础。主要研究结果如下： 1.以热带睡莲和耐寒睡莲种子为试材，研究种子最适的表面灭菌方法，并进一步探究无菌苗的最适萌发基质及最适生长生长调节剂配比，结果表明：（1）延药睡莲等热带睡莲种子的最适表面灭菌方法是75%乙醇处理3min+10%NaClO处理5min，无菌水浸泡30min后接入含有0.1%PPM的培养基中；雪白睡莲等耐寒睡莲种子的最适表面灭菌方法是流水冲洗2h+10g·L-1多菌灵振荡洗涤20min+75%乙醇处理1min+10%NaClO表面灭菌10min+剥去种皮+75%乙醇处理30s+3%次氯酸钠处理3min。（2）采用脱脂棉和蛭石培养基可以加快睡莲种子萌发、显著提高睡莲的发芽率。MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂培养基最适合促进睡莲无菌苗生长。 2.以不同块茎类型的耐寒睡莲为试材，筛选最适合离体培养的睡莲块茎类型及品种，研究褐化的原因及抑制方法，结果表明：（1）根据不同睡莲品种块茎的发芽势、发芽率、污染率、褐化率、褐化半径及生长状况，发现Marliac型和Tuberosa型块茎整体培养效果好，雪白睡莲和‘万维莎’这两个品种最适合离体培养，发芽势、发芽率极高，污染率低，植株叶片增多、整体生长量大。（2）分析发现褐化半径与块茎中TP含量呈显著正相关，相关系数为0.441；与POD活性呈显著负相关，相关系数为-0.418。（3）结合褐化半径及组培苗生长量来看，采用0.2g·L-1AC处理抑制褐化的效果最佳，组培苗生长状态最佳。 3.以耐寒睡莲成熟胚为试材，研究耐寒睡莲愈伤组织诱导及增殖的最佳配方，并探索不同品种耐寒睡莲内源生长调节剂与愈伤组织诱导率的关系，结果表明：（1）睡莲成熟胚愈伤组织诱导的最佳培养基配方：1/2MS+1.5~2.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1TDZ+50g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，诱导率高达74.17%；睡莲愈伤组织增殖的最佳培养基配方：MS+1.0mg·L-16-BA+2.0mg·L-12,4-D+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，愈伤组织成团状增殖，增殖速度较快，且愈伤活性保持较好，颜色呈浅黄绿色。（2）耐寒睡莲成熟胚愈伤诱导率与内源CTK含量呈显著负相关，相关系数为-0.709；与IAA/CTK比值呈显著正相关，相关系数为0.688。
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