摘要
无乳链球菌( Streptococcus agalactiae )又称 B 群链球菌 (group B Streptococcus, GBS),可感染人、多种哺乳动物和鱼类.近年来,GBS感染对于我国水产养殖业特别是罗非鱼养殖造成了巨大经济损失.前噬菌体是细菌间基因水平转移的重要载体,通过插入细菌基因组可为细菌带来新的表型或生物学特性的改变,但目前在GBS中的作用尚不明晰.实验室前期研究发现,鱼源无乳链球菌 GD201008-001 中含有唯一的完整前噬菌体 lamdaSa04.本研究在构建lamdaSa04缺失株的基础上进行一系列生物特性分析,并通过基因分段敲除的方式筛选与前噬菌体介导的特性相关的基因.随后针对其重要元件Ⅱ型毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system, TAS)基因簇A964_0626-0627展开深入研究,以期阐明TAS对于前噬菌体功能发挥的影响. 1 前噬菌体lamdaSa04对鱼源无乳链球菌环境适应性及毒力的影响 为调查前噬菌体lamdaSa04对鱼源无乳链球菌GD201008-001环境适应性和毒力的影响,利用同源重组技术构建前噬菌体lamdaSa04基因缺失株,比较缺失株与野生株在体外生长、抗环境应激、抗巨噬细胞吞噬、胞内存活以及感染小鼠的存活率和组织细菌载量等方面的差异.结果显示,lamdaSa04 基因簇缺失后,并不影响细菌的体外生长能力,但生物被膜形成能力下调 38.57%;在 10 及 20 mmol/L H2O2的强氧化应激条件下,缺失株存活率较野生株分别下调 22.86%及42.01%;小鼠巨噬细胞RAW264.7对缺失株的吞噬率比野生株上调76.12%.模拟巨噬细胞内的酸性及氧化环境,设置强氧化、一氧化氮、溶菌酶、强酸等多因素结合的应激条件,检测菌株的存活率,结果表明lamdaSa04的存在有助于无乳链球菌存活.动物试验结果显示,lamdaSa04缺失对小鼠致死率及组织细菌载量并无明显影响.由此可知,前噬菌体lamdaSa04的存在对无乳链球菌的环境适应性有显著影响,但并不影响细菌的致病性. 2前噬菌体lamdaSa04中毒素-抗毒素系统的鉴定及功能分析 利用基因分段敲除结合生物特性分析,筛选出前噬菌体lamdaSa04显著影响宿主无乳链球菌GD201008-001环境适应性的部分关键基因,并对其中的假定毒素-抗毒素系统基因簇 A964_0626-0627 进行鉴定及功能分析.结果显示,A964_0626及A964_0627基因位于一个操纵子上,且A964_0627为有活性的毒素蛋白,A964_0626 作为抗毒素可以中和毒素 A964_0627 的毒性作用,故二者确构成一对毒素-抗毒素系统,命名为sa04AB.通过构建sa04AB相关缺失株及互补株并进行生物特性分析可知,A964_0626-0627 的缺失使得宿主菌对菌株的抗氧化应激能力下调65. 35%,生物被膜形成能力下调45.09%,且小鼠巨噬细胞RAW264.7对缺失株的吞噬率比野生株上调91.72%.进一步在△lamdaSa04基础上回补A964_0626-0627发现菌株仅生物被膜形成能力得到显著恢复,推测毒素-抗毒素系统sa04AB对于lamdaSa04调控宿主菌生物被膜形成发挥了关键作用. 3毒素-抗毒素系统sa04AB介导无乳链球菌生物被膜形成的机制初探 为了探究TAS/ sa04AB参与 lamdaSa04调控宿主菌生物被膜形成的机制,对前噬菌体lamdaSa04上另一生物被膜形成相关基因A964_0630(clpP)开展研究,探索 clpP 基因与 sa04AB 关系,以及对生物被膜形成的影响.结果显示, clpP单缺失或A964_0626-0627、clpP基因双缺失使得菌株生物被膜形成相较于野生株与△A964_0626-0627 均上调 16%以上,且在△A964_0626-0627 中过表达ClpP可使菌株生物被膜形成下调约64.62%.另外经qPCR及β-半乳糖苷酶检测发现,A964_0626-0627 能够抑制自身以及 clpP 的启动子活性,且△A964_0626-0627的 clpP转录水平上调至野生株的2.92倍.Western blot检测可知,ClpP蛋白酶参与抗毒素蛋白A964_0626的降解.凝胶阻滞试验(EMSA)检测表明,ClpP蛋白并不能与A964_0626-0627直接结合.研究表明,TAS/sa04AB对菌株生物被膜形成能力的影响与其对 clpP 的调控有关,但该调控作用是间接的,具体机制还有待进一步研究. 综上,本研究探究了前噬菌体lamdaSa04在无乳链球菌环境适应性的作用,对其包含的一对毒素-抗毒素系统sa04AB进行了鉴定,并深入分析了sa04AB与前噬菌体lamdaSa04上的clpP基因在无乳链球菌生物被膜形成上的协同调控作用,为进一步阐明无乳链球菌的致病机制提供了新思路.
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