摘要
大豆（Glycine max）是我国非常重要的粮食和经济作物，大豆在生长发育的各个阶段都受到各种病原体的侵染而导致病害发生和成灾。大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的根腐病是全球大豆生产上最严重的土传疾病之一，每年对大豆生产造成巨大的损失。研究表明，大豆疫霉可以通过向宿主体内分泌毒性效应子从而干扰植物的多种信号通路来促进侵染。然而，目前还没有有效药剂和抗病品种来防治该病害发生。因此，研究效应子的致病机理对于保护大豆生产和产业的健康发展有着非常重要的意义。 实验室前期在大豆疫霉效应子中鉴定到了一个能够抑制植物RNA沉默的效应子 Phytophthora suppressor of RNA silencing 1（PSR1），进一步研究发现 PSR1与植物 mRNA 前体剪接因子 16（pre-mRNA splicing factor 16，PRP16）互作，同时也称为 PSR1-Interacting Protein 1（PINP1）。PSR1 过表达和 PINP1 沉默植物呈现出 sRNA 丰度下降的现象，并且 PSR1 在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的表达促进了辣椒疫霉对植物侵染，在大豆中提高了大豆疫霉的定殖。但是PSR1如何调控sRNA生成和植物抗病的分子机制尚不清楚。 在本研究中，我们首先利用CRISPR/Cas9技术将大豆疫霉基因组上PSR1敲除，通过PCR鉴定出3个PSR1敲除的纯合转化子。平板生长实验表明PSR1敲除的转化子并未影响其生长发育。大豆下胚轴接种结果表明，与野生型大豆疫霉相比，PSR1 敲除的大豆疫霉转化子致病性明显降低。这些结果明确了 PSR1 在大豆疫霉侵染宿主过程中发挥毒力是非常重要的。 我们接下来分析了动物、植物和卵菌中 PINP1 同源蛋白序列，发现 PINP1和PINP1同源蛋白N端相似性较低，而C末端非常保守，同时所有的PINP1同源蛋白都包含了一个 DEAH-box RNA 解旋酶结构域。酵母双杂交和 BiFC 实验表明 PSR1 与所有检测的PINP1 同源蛋白互作，并且 PINP1 的 C-末端的三个保守的结构域，DEAH、HA2和DUF1605，是其与PSR1相互作用的关键结构域。由于 PINP1 及其同源蛋白序列比较保守，我们进行了酵母互补实验，结果表明PINP1能互补prp16缺失酵母菌株的生长缺陷表型。这些结果表明植物PINP1与酵母PRP16可能功能是很保守的。 利用生物信息学分析 PINP1 蛋白序列，发现 PINP1 含有一个保守的DEAH-box RNA 解旋酶结构域，我们通过体外解旋酶实验明确了 PINP1 是一类主要利用水解ATP提供能量的RNA解旋酶。ATP酶活性实验表明了PINP1具有ATP水解活性和PINP1突变体影响了ATP酶活性，并且PINP1及其突变体的酶活性都需要结合拟南芥总 RNA。RNA EMSA 揭示了 PINP1 结合一般 80 nt sRNA （ssRNA和dsRNA）。 前期研究结果发现在PINP1沉默和PSR1过表达植物中sRNA积累明显降低。为了揭示PSR1和PINP1调控sRNA生成的分子机制，我们挑选了26个sRNA通路基因，并进行了蛋白互作分析。酵母双杂交实验表明PINP1和PSR1都不能与 sRNA 通路关键成分蛋白互作，通过 RNA EMSA 和 RNA IP 实验，我们明确了PINP1结合pri-miRNA来调控植物体内miRNA生成。感兴趣的是，我们发现在体外解旋酶实验和 RNA EMSA 中 PSR1 抑制了 PINP1 的解旋酶活性和 RNA结合活性，也确定 PSR1 抑制 PINP1 结合 pri-miRNA 能力，RNA pull-down 实验进一步表明了PSR1抑制了PINP1结合pri-miRNA。这些结果表明了PSR1通过与PINP1的互作来干扰其与pri-miRNA结合能力，从而调节植物体内sRNA生成。 PINP1基因预测编码了前体mRNA剪接因子PRP16。为了研究PINP1对于pre-miRNA剪接的作用以及PSR1对PINP1剪接能力的影响。我们对PSR1过表达和PINP1沉默的植物进行了RNA-seq分析。结果发现在PINP1沉默和PSR1过表达植物中大量的基因发生了可变剪接（AS）事件，其中内含子保留（IR）是可变剪接最多的类型。RT-PCR和qRT-PCR实验也验证了在PINP1沉默和PSR1过表达植物中存在的可变剪接基因和事件。这些结果表明了 PSR1 可能通过与PINP1相互作用来调控拟南芥可变剪接。为了确定内含子保留的剪接异构体可以翻译成异常蛋白。我们进一步通过 Western bolting验证了在 PINP1 沉默和 PSR1过表达植物中DCL2和DCL3的IR剪接形式产生了截断蛋白；明确了发生内含子保留的五个 sRNA 和 JA 信号通路相关基因（AGO4、CPL4、AOC2、OPCL1和MES10）参与植物防御反应；阐明了发生IR基因的截短蛋白可以提高植物对疫霉菌的侵染。总的来说，这些结果揭示了大豆疫霉效应子PSR1通过与PINP1互作，抑制了PINP1结合pri-miRNA和pre-mRNA剪接能力来调控sRNA生成与植物防卫反应。
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