摘要
树突状细胞（Dendritic Cell，DCs）作为专职抗原递呈细胞（Antigen Presenting Cell， APC），是目前公认递呈能力最强的细胞，是先天免疫和获得性免疫的桥梁。活化的DCs由注射部位迁移到引流淋巴结，进而诱导幼稚性T淋巴细胞分化为不同类型的效应T细胞，对于启动和调节CD4+和CD8+T细胞免疫反应至关重要，对机体产生获得性免疫应答起关键作用。细胞免疫是由T淋巴细胞介导的免疫。CD4+T淋巴细胞介导的分泌IFN-γ为主的Th1型免疫应答和分泌IL-4为主的Th2型免疫应答在抗感染免疫中发挥重要作用；CD8+T淋巴细胞也称细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL），与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线；CD8+T细胞还可以通过表达分泌诸如TNF-α、IFN-γ等细胞因子来间接杀死靶细胞。CD8+T淋巴细胞不仅可以有效杀灭胞内感染细胞，而且在易变异毒株间因交叉保护不足的病毒疫苗研制上，CTL应答可以提供高水平的交叉保护。 本课题首先体外诱导培养C57BL/6小鼠DCs，评价CVC1302促进DCs活化、抗原交叉递呈能力、分泌细胞因子水平及胞内环境变化等，其次体内试验评价CVC1302配伍抗原免疫小鼠后促进抗体、抗体分型、CD8+T细胞活化及特异性CTL能力，了解CVC1302对细胞免疫，特别是CD8+T细胞免疫的提升，进而阐释其作用机制,为高效灭活疫苗的研制提供理论支撑。论文研究内容分为以下两部分： 试验一 CVC1302促进DCs活化及交叉递呈能力 本实验首先分离6~8周龄C57BL/6小鼠骨髓源细胞，体外培养获得DCs，利用无内毒素OVA抗原及免疫增强剂CVC1302进行体外刺激，分别设CVC1302+OVA组、单独OVA组和空白对照组，通过流式细胞术检测DCs活化比率及其表面共刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-I的表达量；检测刺激24 h后，细胞上清中细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-12p70）含量；利用活性氧（ROS）试剂盒检测刺激1、3 h后DCs胞内ROS变化趋势；CVC1302+OVA-FITC和OVA-FITC分别体外刺激后40、60 min，利用SIM超高分辨显微镜观察DCs胞内OVA-FITC的数量、存在时间及与溶酶体定位的变化情况；利用负载抗原DCs与B3Z细胞共同培养，检测B3Z细胞整体活化情况。结果显示：CVC1302+OVA组与单纯OVA组相比，DCs活化率显著提升（p＜0.001），表面成熟分子CD40、CD80、CD86及MHC-I的表达量显著提升（p＜0.001、p＜0.01、p＜0.01， p＜0.001），DCs分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12p70水平显著提升（p＜0.0001、p＜0.01、p＜0.0001）；CVC1302提升DCs吞噬抗原能力、留存时间及胞内ROS水平，且抗原与溶酶体共定位减少；CVC1302+OVA组与单独OVA组相比，DCs活化B3Z细胞量显著提升（p＜0.0001）。本实验成功建立了利用Flt3-L对C57BL/6小鼠骨髓源树突细胞体外培养及鉴定，证明CVC1302可显著提高体外培养DCs的活化率及相关表面分子表达量，并促进DCs对抗原的吞噬和交叉递呈的发生，为后续免疫增强剂CVC1302介导细胞免疫的机制研究，奠定了试验基础。 试验二 CVC1302对机体特异性免疫的影响 为探究免疫增强剂CVC1302在小鼠体内对细胞免疫的影响，本实验利用模式抗原OVA，制备疫苗免疫C57BL/6小鼠，通过ELISA检测特异性血清抗体水平，利用流式细胞术分析引流淋巴结DCs数目和CD8+T细胞增殖水平并评价体内CTL杀伤效率。通过免疫6~8周龄C57BL/6小鼠，分别设CVC1302+OVA组、单独OVA组和空白对照组；眼眶采血并分离血清，利用ELISA检测免疫28、60、90及120d的小鼠血清中特异性抗体及亚型IgG1和IgG2a的效价；利用流式细胞术检测免疫后1、3、5、7d小鼠引流淋巴结中DCs数目和CD8+T细胞活化水平，同时检测免疫7d后小鼠体内特异性CTL杀伤效率，结果显示：CVC1302+OVA组与单纯OVA组相比，免疫小鼠28、60、90及120d后，血清抗体IgG效价水平显著提升，差异极显著（p＜0.001、p＜0.01、p＜0.05、p＜0.05），抗体亚型IgG1差异不显著（p＞0.05），但是IgG2a差异极显著（p＜0.0001、p＜0.0001、p＜0.0001、p＜0.01）；CVC1302+OVA组与单纯OVA组对比，免疫后1、3、5、7d，小鼠引流淋巴结中DCs招募数量和CD8+T细胞数量极显著提升（p＜0.0001）；体内CTL杀伤水平显著升高（p＜0.01）。本实验成功验证CVC1302有利于体内特异性抗体水平显著提升，确认CVC1302对小鼠引流淋巴结募集DCs和活化CD8+T细胞有明显促进作用，对机体发挥CTL反应具有显著提升影响，为后续免疫增强剂CVC1302在不同血清型疫苗上的交叉免疫保护作用提供研究数据。
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