摘要
菊花（Chrysanthemum morifolium）原产中国，为菊科菊属（Chrysanthemum L.）多年生宿根草本花卉，是重要的观赏花卉之一，因其花色艳丽、花型丰富、形态多样并且兼顾药用、食用和茶用价值而备受大众喜爱。菊花应用广泛，在生产中易遭干旱、低温、盐等胁迫，影响植株生长及品质。另外，菊花多为短日照植物，通常于10～11月份开放，自然花期难以满足周年供应。因此，探究菊花耐逆性及花期调控分子机制，对于改善菊花花期、提高菊花的抗逆能力具有十分重要的意义。miR156 是一种广泛存在于植物体内负调控基因表达的内源性非编码单链小 RNA，长度为 21 nt，结构保守，是植物生长发育过程中的一类重要调控因子，在植物营养相变、形态建成、果实发育、次生代谢和胁迫应答等方面发挥重要作用。miR156的靶基因SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）家族在成花转变、营养器官发育、生物和非生物胁迫响应中具有重要调控作用。但菊花中关于miR156及其靶基因SPL的具体功能未见报道。本课题组在先前的研究中证明了菊花 CmSPL13 为 miR156 的靶基因之一，为此，本研究开展了对miR156和CmSPL13的功能鉴定，克隆了miR156的启动子并明确其在非生物胁迫下的表达特性，通过遗传转化菊花明确了 miR156 和 CmSPL13 的功能。主要研究结果如下： 1. 为研究菊花miR156可能参与的响应路径，克隆获得了1,584bp的启动子序列，分析发现其含有茉莉酸甲酯响应元件 TGACG-motif、水杨酸响应元件 TCA-element、生长素响应元件 TGA-element，及参与干旱诱导响应元件 MBS 等；根据启动子上的顺式作用元件分别对菊花‘神马’进行茉莉酸（MeJA）、水杨酸甲酯（SA）、生长素（NAA）和干旱（20% PEG6000）处理，通过 qRT-PCR 检测 miR156 的表达水平。结果表明，在0.1 mM 的MeJA 处理下，miR156 的表达水平先升高后逐渐下降，0.1 mM的 SA 处理下 miR156的表达量逐渐升高，在 0.3 mM 的 NAA 的处理 miR156 的表达水平显著下调，20% PEG 处理使 miR156 表达量显著降低。表明 miR156 参与 MeJA、SA、NAA和干旱胁迫的响应过程。 2. 为进一步研究 miR156 在菊花中的功能，分别构建植物超表达载体pMDC32-miR156 （ miR156OX ）和沉默载体 pORE-R4-STTM15 ，将二者以及pORE-R4-CmSPL13（CmSPL13OX）遗传转化菊花。对野生型阳性苗进行干旱处理并复水一周后发现，野生型的存活率为33.0%，miR156OX-2和miR156OX-17超表达株系的存活率分别为34.1%、34.5%，STTM56-8和STTM56-15沉默株系的存活率分别为78.2%、81%，CmSPL13OX-4和CmSPL13OX-15超表达株系的存活率分别为77.2%、76.3%。统计野生型和转基因株系的气孔开放度，发现STTM156和CmSPL13转基因株系的气孔开度明显小于野生型，而超表达株系略大于野生型。荧光定量结果表达，负调控表皮气孔开放的基因CmCIPK6和CmBDG1的表达在miR156超表达株系中显著下调，在沉默株系和 CmSPL13 超表达株系中显著上调，而 ABA 生物合成基因CmABA1和ABA信号路径基因CmABI1的表达没有显著差异，推测miR156可能通过影响气孔开放度而不依赖ABA信号调节菊花的抗旱性。通过NBT和DAB染色检测植株活性氧水平，结果显示 miR156 沉默株系和 CmSPL13 超表达株系在干旱处理后的染色程度比野生型要弱，而超表达株系的染色程度略深于野生型。PEG处理后的转基因株系和野生型的活性氧清除酶编码基因（SOD、CAT、APX）的表达变化显示，干旱处理下三个活性氧清除酶编码基因的表达量均升高，且STTM156转基因株系中的升高趋势最为明显，CmSPL13OX次之，miR156转基因株系中最弱。 3. 观察 miR156OE、STTM156 及 CmSPL13OE 转基因菊花‘神马’叶片形态发现，miR156OE转基因株系平均在第5～6叶位进入成熟叶，野生型WT在第4～5叶位进入成熟叶相变，STTM156和CmSPL13OE转基因株系的成熟叶相变提前至第4叶位，表明miR156延长了菊花的幼年期；miR156OX-2、miR156OX-17转基因菊花花期分别推迟 2.1 d、1.8 d，STTM156-8、STTM156-15 转基因菊花花期分别提前 8 d、7.5 d，CmSPL13OX-4、CmSPL13OX-15 转基因菊花花期分别提前 9.5 d、8.8 d。miR156超表达转基因株系中开花整合子 CmFTL3、CmSOC1、CmAP1、CmFUL 的表达量下调，而STTM156和CmSPL13超表达转基因株系中开花相关基因的表达量上调。
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