摘要
近年来，随着饲料禁抗令的实施，断奶后仔猪腹泻及肠道炎症的问题更加严峻，饲料替抗产品研究迫在眉睫。低聚糖是益生元的主要形式，猪本身难以消化这些物质，利用它们的主要是肠道中的微生物菌群。母乳低聚糖是母乳中第三大固有成份，而2''-岩藻糖基乳糖（2''-FL）是母乳低聚糖中最丰富的岩藻性低聚糖。有研究报道，母乳低聚糖对婴儿肠道微生物的建立起关键作用，然而2''-FL对仔猪肠道微生物及其代谢的影响鲜有研究。另外，目前2''-FL成本较高，研究开发类似功能的低聚糖或基于2''-FL筛选益生菌对仔猪生产具有潜在应用价值。因此，本文以体外发酵方法分别研究2''-FL及甘露低聚糖（MOS）对断奶仔猪肠道菌群及其代谢的影响，并以2''-FL为底物富集分离主要优势菌，研究其发酵仔猪全价料的特性，旨在为仔猪饲料替抗产品的研发提供参考依据。具体研究分为以下三个部分： 1 体外法探究 2′-FL 对仔猪肠道微生物发酵参数的影响 以仔猪空肠及结肠食糜为接种物，分别设计4组不同的底物进行发酵，依次是空白对照组（Blank）、2''-FL组、低聚果糖组（FOS）和乳糖组（Lactose），在五个时间点（0、6、12、24、48 h），每组在除 0 h 外每个时间点设有 4 个重复，0 h 只设置 4个空白重复，分别检测5个时间点的产气量和pH值并收集发酵液样品测定代谢产物与菌群组成。研究结果显示，在空肠微生物发酵过程中，随发酵时间的进行，2''-FL组相比于乳糖和FOS 组产气量显著较低，pH 值则显著较高（P ＜ 0.05）；在结肠微生物发酵过程中，随发酵时间的进行，2''-FL组产气量显著低于乳糖和FOS组（P ＜ 0.05）， pH值发酵过后差异不大，但前期下降较慢。相比于其他组，2''-FL被仔猪空肠菌群利用，产生丙酸能力更强；而在结肠中产乙酸及总 SCFA 能力突出（P ＜ 0.05）。 微生物分析结果显示，在空肠微生物发酵中，2''-FL 显著改变了各时间点辛普森指数（Simpson）、香农指数（Shannon）、Chao 指数（Chao 1）和 Ace 指数（P ＜ 0.05）。在结肠微生物发酵中，2''-FL 显著改变了发酵 6 h 的 Shannon 指数、12 h 的 Simpson 和Shannon 指数（P ＜ 0.05）。空肠微生物发酵中，2''-FL 对于发酵液中变形菌门和拟杆菌门的相对丰度有显著影响（P ＜ 0.05）；结肠发酵中，2''-FL 对厚壁菌门的相对丰度有显著影响（P ＜ 0.05）。属水平上，2''-FL 显著提高了空肠Lactococcus、Prevotella_9、Blautia 和 Escherichia_Shigella 等菌属的相对丰度，显著提高了结肠 Blautia、Subdoligranulum 和 Roseburia 的相对丰度（P ＜ 0.05）。 2 体外法探究 MOS 对仔猪肠道微生物发酵参数的影响 分别采用仔猪空肠与结肠食糜作为接种物，设计3组不同的底物，依次是Blank、FOS和 MOS 组，在 5 个时间点（0、6、12、24、48 h）分别测定产气量、pH 值，并收集发酵液进行后续分析。研究结果显示，空肠微生物发酵，MOS 和 FOS 组 pH 值在 12 h下降最多，之后达到平稳期，然而产气量则很少；发酵 24 h 后，与 FOS 组相比，MOS组显著提高了乙酸、丙酸及总短链脂肪酸的含量（P ＜ 0.05）。结肠微生物发酵 24 h 后， MOS 组乙酸和丁酸的产量显著高于 FOS 组（P ＜ 0.05）。在空肠微生物发酵中，MOS组在发酵初始阶段产甲酸能力显著高于 FOS 组（P ＜ 0.05），发酵 12、24 h 反而低于FOS 组；发酵 0~12 h，乳酸大量产生，造成 pH 值快速下降，FOS 组乳酸产量高于MOS 组。在结肠微生物发酵中，MOS 组在发酵 48 h 甲酸和乳酸产量显著高于 FOS组（P ＜ 0.05）。空肠发酵液微生物结果显示，MOS 组与 FOS 组 Chao 1 和 ACE 指数无显著差异，而发酵 48 h 的 Shannon 和 Simpson 指数在 MOS 组显著高于 FOS 组（P ＜0.05）。不同底物的各组在门水平上的优势菌门均为Proteobacteria及Firmicutes；在属水 平 各 组 的 主 要 优 势 菌 属 为 Streptococcus、Escherichia_Shigella 和Clostridium_sensu_stricto_1 等 。 发 酵 48 h 后 ， MOS 组 Bifidobacterium 、Limosilactobacillus、Prevotella-9 的相对丰度显著高于 FOS 组（P ＜ 0.05）。 3 分离筛选 2''-FL相关菌株及其发酵仔猪全价料特性的研究 通过分离筛选试验一2''-FL发酵后菌液中的菌株，挑选几种益生菌研究其发酵仔猪全价料的特性。首先将 2''-FL 发酵后的发酵液进行富集培养，通过严格筛选得到 8种单菌，然后挑选5种菌株，分别是粪肠球菌（C）、乳酸片球菌（R）、戊糖乳杆菌（W）、副兰乳杆菌（F）和罗氏柠檬乳杆菌（L），进行抑菌试验及生化鉴定。结果显示：W， F和C对沙门氏菌的抑菌效果最明显；C和R对大肠杆菌K88的抑菌效果最明显。生化鉴定结果只有R菌显示为全部阳性，另外W，F和C除了对棉子糖为阴性，对其它物质则都表现为阳性。 发酵饲料分为五种单菌发酵及复合菌发酵，分别是LF，FR，CR，CL 和 WFR，另外设置空白对照（添加培养基）。发酵饲料特性的结果显示：W，F 和 L 发酵饲料的 pH 值显著低于其他几组（P ＜ 0.05）。在复合菌组，WFR 与 FR 组合菌发酵饲料 pH值显著低于其他组（P ＜ 0.05）。在单菌组中，W组在饲料发酵后菌落数显著高于其他组，F 和 L 组饲料发酵后菌落数远低于空白对照组（P ＜ 0.05）；复合菌中，FR 组菌落数显著高于其他组（P ＜ 0.05），其他几组菌落数都显著低于空白组（P ＜ 0.05）。饲料单菌发酵后，相比于空白对照组，各组显著降低了饲料中粗蛋白的含量（P ＜ 0.05）；W、R、C 组乙酸产量显著高于其他几组，W组最高（P ＜ 0.05）；单菌发酵均显著提高了饲料乳酸含量，另外 L 和 W组的乳酸产量显著高于其他几组（P ＜ 0.05）；而饲料中总氨基酸含量则是 B 和 R 组最高（P ＜ 0.05）。饲料复合菌发酵，FR、CR 和 WFR组的粗蛋白含量显著降低（P ＜ 0.05）；CR和CL组乙酸产量显著高于其他组（P ＜ 0.05）；复合菌各组乳酸产量都显著高于空白对照组（P ＜ 0.05），各处理组之间无显著差异；各处理组饲料总氨基酸含量均显著低于空白组（P ＜ 0.05）。 综上所述，2''-FL能够调节仔猪肠道菌群结构，表现出与乳糖和FOS不同特性；2''-FL被仔猪肠道微生物能利用产生大量 SCFA，尤其是乙酸和丙酸。与FOS 底物相比，仔猪空肠微生物能利用MOS产生大量短链脂肪酸，尤其是丙酸；而仔猪结肠微生物利用MOS产生的乙酸和丁酸能力更强；并且，MOS能改善仔猪小肠微生物区系，提高双歧杆菌的丰度。基于2''-FL底物富集筛选了5种乳酸菌株，而接种益生菌的固体全价料品质优于自然发酵饲料，所筛选单菌及复合菌均在一定程度上表现出益生特性。
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