摘要
目的： 1. 明确可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物是否存在相分离性质。 2. 阐明SNARE复合物相分离形成的分子机制。 3. 明确SNARE复合物相分离对SNARE复合物主要生物学功能的影响。 方法： 在本研究中，人胚胎肾细胞（ HEK-293T ）细胞分别转染EGFP-VAMP2、EGFP-SNAP25、EGFP-Syn1、EGFP对照质粒和共转染EGFP-VAMP2和EGFP-SNAP25，EGFP-VAMP2和EGFP-Syn1， EGFP-SNAP25和EGFP-Syn1，以及EGFP-VAMP2和EGFP-SNAP25和EGFP-Syn1，共聚焦显微镜观察SNARE蛋白单体、单体两两之间和复合物是否有液滴聚集现象。其次，分别构建不同荧光标记的mCherry-VAMP2、EGFP-SNAP25 和 CFP-Syntaxin1 质粒，共转染 HEK-293T 细胞，观察液滴是否由不同颜色荧光蛋白共同形成。然 后，合 成 并 纯 化 mCherry-VAMP2、EGFP-SNAP25 和CFP-Syntaxin1 重组蛋白，加入不同浓度拥挤剂和NaCl溶液，检测SNARE 蛋白单体（VAMP2、SNAP25 和 Syntaxin1）和 SNARE 复合物相分离现象。并通过荧光漂白恢复（FRAP）和融合-分离实验评估胞内和胞外重组蛋白系统相分离液滴的流动性和可逆性。接下来，将蛋白液滴与有膜细胞器与外泌体和囊泡进行共定位分析，排除液滴是有膜细胞器和囊泡的可能性。并且通过构建SNARE复合体的截断体，确定SNARE复合物发生相分离的主要结合域。最后，检测调控SNARE 复合物形成的主要蛋白突触前膜囊泡锚定蛋白 MUNC-13和 MUNC-18 对SNARE 复合物相分离液滴形成的影响。我们研究的创新之处在于提供了一个合适的模型，可以确定 SNARE 复合体是作为单体还是作为复合物发挥作用，以及需要多少个 SNARE 复合体一起工作才能维持神经递质的持续释放，并为未来探索膜融合和神经传递背后的机制奠定了重要基础。 结果： 1.通过生物信息学预测发现 SNARE 蛋白单体 VAMP2（1-81）、SNAP25（1-81，160-206）和 Syntaxin1（1-209）蛋白均存在广泛的 IDR。 2. HEK-293T 细胞共转染 VAMP2、SNAP25 和 Syntaxin1 质粒形成 SNARE 复合物后出现明显液滴聚集现象，且Syntaxin1 是液滴形成的前提条件。 3.不同颜色荧光标记的mCherry-VAMP2、EGFP-SNAP25 和CFP-Syntaxin1 质粒，共转染 HEK-293T 细胞后显示液滴由这三个蛋白单体共同组成，且液滴大小呈现蛋白浓度依赖性。 4. SNARE 复合物形成的液滴具有光漂白恢复（FRAP）和融合-分离特性，且排除液滴是有膜细胞器、外泌体和囊泡的可能性。 5.体外重组蛋白系统结果显示 SNARE 复合物可在体外可形成明显液滴聚集现象，并具有光漂白恢复（FRAP）和融合-分离特性,不同浓度拥挤剂和NaCl溶液可影响液滴的数量和大小。 6. 1,6-己二醇处理细胞内和体外重组蛋白SNARE复合物的蛋白液滴，不同浓度1,6-己二醇都可以影响SNARE相分离的液滴，且随着处理时间的延长和1,6-己二醇的浓度升高，液滴逐渐减小。 7.通过构建SNARE复合体的截断体，最终确定Synaxin-1的IDR区域不是驱动SNARE LLPS 所必须的，Synaxin-1的肽(210-288)是主要发生相分离的结合域。 8.不同浓度Munc13和 Munc18可影响SNARE复合物液滴大小。 结论： 1. SNARE复合物存在相分离现象。 2. Synaxin-1的非 IDR 区域介导 SNARE 复合物相分离形成。 3. SNARE复合物可能通过液液相分离介导突触膜融合和神经递质释放。
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