摘要
青菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）原产于中国，属于十字花科芸薹属白菜亚种，在长江中下游有广泛的种植，现已成为一种重要的绿叶菜。青菜霜霉病由专性寄生菌霜霉菌（Hyaloperonospora brassicae）引起，植株染病后叶片会出现大量黄斑，严重影响其产量和品质性状。霜霉病菌喜低温、高湿环境，因此，每年十月下旬至次年二月青菜主产区发病最为严重。现阶段，青菜霜霉病的防治主要依赖杀菌剂，以预防为主，但效果仍然不佳，并且杀菌剂的施用会导致田间耐药性病原菌的出现。因此，鉴定青菜抗霜霉病基因，研究其分子调控机制，培育抗病品种是防治青菜霜霉病的根本途径。本研究通过分析高抗自交系（R）和易感自交系（S）青菜种质在接种霜霉菌后的转录组差异，鉴别到水杨酸介导的免疫信号通路在青菜抗霜霉病过程中起到重要作用，推测 BraNPR1 是该过程中的核心调控蛋白。利用青菜 VIGS（Virus-induced gene silencing）瞬时转化体系，对 BraNPR1 进行了抗病功能验证，并通过酵母双杂交系统初步筛选到BraNPR1 的候选互作蛋白。本研究结果为深入解析青菜响应霜霉病菌胁迫的应答机制，培育青菜抗霜霉病新品种奠定了基础。主要研究结果如下： 1、水杨酸信号通路在青菜抗霜霉病过程中起关键作用 本研究对 R 和 S 在接种霜霉菌前后 12 h 的样本（R0, R12, S0, S12）进行了转录组测序，在转录水平上宏观比较了 R 和 S 在感染霜霉菌前后的差异（R12_VS_R0有7206个DEGs，S12_VS_S0有8958个DEGs），以及R和S品种之间的差异（R0_VS_S0有7132个DEGs，R12_VS_S12有6362个DEGs）。GO和KEGG富集结果表明，青菜响应霜霉菌胁迫的差异表达基因（DEGs）显著富集在植物-病原体互作、植物激素信号转导和光合作用通路。转录组数据中水杨酸信号转导通路的关键基因NPR1（BraC09g012960）及3个NPR1的下游调控基因PRs（BraC03g044030、BraC09g064720、BraC06g014450）在抗病材料中显著上调。对侵染霜霉菌的抗病材料内源激素含量检测发现，水杨酸含量上调，其它抗逆激素（茉莉酸，脱落酸，乙烯）含量下调。对R和S喷施外源水杨酸处理后，水杨酸受体BraNPR1及其下游调控基因BraPR1和BraPR5表达量显著上调。以上结果说明，水杨酸信号通路在青菜抵御霜霉菌胁迫中起重要作用。本研究还筛选到BraICS1、BraWRKY46、BraWRKY70和BraPAD4参与了水杨酸介导的青菜抗霜霉病免疫通路。 2、水杨酸信号通路中的BraNPR1对青菜抗霜霉病具有正调控作用 转录组分析结果显示，水杨酸介导的免疫通路在青菜抗霜霉病中起重要作用。为进一步验证该结果，本研究利用青菜VIGS瞬时转化体系对水杨酸受体蛋白基因 BraNPR1 进行了抗病功能的验证。BraNPR1 基因 CDS 序列长 1713 bp，编码570 个氨基酸，选取该基因 CDS 序列中 500 bp 保守序列构建 pCVA-BraNPR1 沉默载体，通过真空渗透法在青菜萌芽期进行瞬时转化。荧光定量PCR结果显示， pCVA-BraNPR1转化株在转化14天后，叶片中BraNPR1表达量显著下调。对离体叶片接种霜霉菌后发现，转化株青菜叶片病斑面积显著高于对照组。上述结果表明，BraNPR1对青菜抗霜霉病具有正调控功能。为进一步解析青菜抗霜霉病分子机制，本研究还建立了受到霜霉菌侵染青菜叶片的cDNA酵母双杂交文库，以BraNPR1 为诱饵蛋白构建 pGBKT7-BraNPR1 诱饵载体，筛选到 BraPYL7 ， BraCML35，BraWRKY46，BraPR5和BraKNAT4等BraNPR1的候选互作蛋白，这为进一步深入解析BraNPR1调控青菜抗霜霉病的分子机制提供了重要线索。
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