摘要
细胞之间存在着丰富的异质性。在许多重要的生命过程中，如肿瘤发生发展、免疫系统发育、胚胎生长发育等，单个细胞所呈现出的表型和不同细胞之间的差异均具有极为重要的研究价值。单细胞分析通过对单个细胞的基因组、转录组、表观遗传组等方面的分析，揭示了细胞的异质性特征，为深入研究疾病的发展过程、细胞谱系的示踪、细胞功能图谱的绘制等提供了强大的支持。DNA、RNA和蛋白质等多种分子共同调节单个细胞的表型和功能，仅依靠单一维度的分析很难获得全面的细胞表型信息。通过单细胞多组学分析技术，可以在多个层面综合分析细胞的异质性，建立不同组学之间的联系，从而更深层次地探索单个细胞的状态、发育过程和功能作用。 单细胞水平上对DNA甲基化组和转录组的联合分析揭示了甲基化如何调控转录表达。然而，传统的单细胞DNA甲基化组和转录组联合分析方法仍然存在以下弊端：1、基于流式细胞分选或显微镜拾取的单细胞分离策略既耗时又费力，且在分离过程中容易发生RNA降解；2、在频繁的移液操作中，基于温和质膜裂解缓冲液所进行的核-质分离容易导致微小的细胞核丢失；3、微量单细胞内含物的扩增效率相对较低，且试管的开放环境容易受到外界污染。 针对上述问题，本文发展了一种高效而经济的基于数字微流控技术的单细胞DNA 甲基化组和转录组联合分析方法。其通过非接触和可寻址的方式，实现了包括单细胞分离、细胞裂解、核酸分离以及DNA甲基化组/转录组文库构建的全自动工作流程。具体工作如下： （1）发展了一种基于数字微流控技术的单细胞转录组和 DNA 甲基化组文库构建平台。通过在芯片上构筑亲水性位点，借助表面张力，实现对单细胞快速而高效的分离。利用低渗裂解策略和磁力辅助，实现对mRNA和细胞核DNA的高效分离。基于Smart-seq2测序技术，将所得的mRNA分离物进行单细胞转录组建库并上机测序。以K562和GM12878细胞系作为模型，在转录组层面，该平台确保了高准确性（R＞0.85）和高基因检测能力（400万读数测序深度下，每个细胞平均可检测到14697个基因）；基于scRRBS测序技术，将所得的细胞核分离物进行单细胞甲基化组建库并上机测序。以两种相同细胞系作为模型，在DNA 甲基化组层面，该平台确保了高准确性（R＞0.85）和高 CpG 覆盖率（100万读数测序深度下，每个细胞平均可覆盖到677198个CpG位点）。综上所述，无论是检测转录组还是DNA甲基化组，该平台均具有高灵敏、高准确的突出检测能力。 （2）基于上述研究成果，开展了建立单细胞 DNA 甲基化组和转录组联合分析方法的研究，该方法成功解析了单细胞不同基因组背景下 DNA 甲基化与RNA转录表达之间的关系。此外，为了验证该方法具有揭示单细胞水平上DNA甲基化是如何调控基因表达的能力，本工作进一步应用该方法探讨了单细胞水平地西他滨（一种具有甲基化抑制作用的抗肿瘤药物）对甲基化调控转录活动的影响，并首次鉴定出对地西他滨治疗响应的启动子/基因体的甲基化驱动基因。此外，该方法还帮助揭示了地西他滨诱导的高甲基化抑癌基因的重新激活机制和对原癌基因表达的抑制机制。 综上所述，该单细胞转录组和DNA甲基化组联合分析方法能够灵敏、准确且高效地在单细胞水平上构建DNA甲基化与RNA转录表达之间的关系网络，显示出其在生物系统单细胞研究中的重要潜力。
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