摘要
目的： 探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）移植对衰老小鼠卵巢功能的影响；观察二甲双胍处理是否可增强hUC-MSCs对衰老小鼠卵巢的改善作用；初步探讨二甲双胍处理的hUC-MSCs改善衰老小鼠卵巢功能的作用机制。 方法： 1. 小鼠卵巢衰老模型筛选与评价：对8周龄和32周龄C57小鼠进行阴道涂片，观察动情周期；卵巢组织HE染色观察卵巢结构并进行窦卵泡计数。 2. hUC-MSCs的制备与鉴定：制备：体外无菌条件下收集及处理人脐带，采用组织块贴壁法培养；显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析干细胞阳性、阴性标记物，定向诱导其成骨、脂肪分化。 3. 二甲双胍处理hUC-MSCs：采用含有500 mM浓度的二甲双胍培养液培养hUC-MSCs。 4. hUC-MSCs移植：将60只32周龄雌性C57小鼠随机分成3组，分别为对照组、hUC-MSCs移植组和二甲双胍处理的hUC-MSCs（Met+hUC-MSCs）移植组，每组20只。Met+hUC-MSCs和Met+hUC-MSCs组通过尾静脉每周以1×107个/kg浓度（悬浮于200ul PBS中）移植hUC-MSCs，每周注射一次，连续3次，对照组同时尾静脉注射同体积PBS。最后一次移植4周后收样进行后续实验。 5. 卵巢功能检测：通过阴道涂片观察并记录发情周期；ELISA检测血清FSH、LH和AMH水平；肉眼观察及称重卵巢大小计算卵巢体重指数；HE染色观察卵巢结构并计数各级卵泡数量。 6. Met+hUC-MSCs移植对卵巢功能影响的机制初探：免疫组化及WB分析衰老、凋亡相关蛋白的表达水平，免疫荧光检测卵巢组织增殖标志物表达情况，蛋白组学测序Met+hUC-MSCs移植差异表达蛋白，生物信息学分析Met+hUC-MSCs移植差异表达蛋白富集通路及筛选可能作用蛋白。 结果： 1. 卵巢衰老模型评估：与年轻小鼠(8周龄)相比，衰老小鼠（32周龄）动情周期紊乱，正常动情周期所占比例显著下降，卵巢体积变小，结构模糊不清，卵巢实质被间质细胞占据，各级卵泡消失。 2. hUC-MSCs鉴定: 显微镜下观察培养细胞形态呈短梭形，符合干细胞形态特征。流式细胞术分析显示，干细胞阳性标志物CD73、CD90和CD105表达阳性，阴性标记物Neg不表达，P4代hUC-MSCs成脂诱导分化后饱和油红O染色为阳性，成骨诱导分化后茜素红染色阳性。 3. 二甲双胍增强hUC-MSCs成骨分化能力：与NC组相比，500mM二甲双胍与hUC-MSCs共培养后可增强hUC-MSCs的成骨分化能力。 4. Met+hUC-MSCs移植对小鼠体重减轻的影响：实验期间，对照组小鼠体重显著下降，但Met+hUC-MSCs移植组小鼠体重与处理前体重几乎保持不变，下降趋势显著低于对照组。 5. Met+hUC-MSCs对卵巢功能的影响：与对照组相比，Met+hUC-MSCs移植组小鼠动情周期紊乱比例显著下降；与对照组和hUC-MSCs组相比， Met+hUC-MSCs移植组卵巢体积及卵巢指数显著增高；HE染色后组织学观察，对照组小鼠卵巢结构模糊不清，皮质区未见明显卵泡， hUC-MSCs和Met+hUC-MSCs移植组卵巢结构清晰，皮质区可见到各级卵泡，且各级卵泡数显著高于对照组，而Met+hUC-MSCs组卵泡数量最多，显著高于对照组和hUC-MSCs组；此外，相比对照组，Met+hUC-MSCs组小鼠血清AMH和LH水平显著增加，FSH水平显著下降。 6. Met+hUC-MSCs移植改善卵巢功能的机制初探：WB实验结果显示，与对照组比较，Met+hUC-MSCs移植组衰老正相关基因P53显著下调，凋亡负相关基因bcl-2显著上调；免疫组化结果显示Met+hUC-MSCs移植组的凋亡正相关基因BAX、Caspase3显著下调，负相关基因Bcl-2显著上调，细胞增殖标记物Ki67显著上调。蛋白组学测序结果发现，Met+hUC-MSCs移植有664个蛋白显著差异表达，且差异表达蛋白在线粒体相关通路上富集。与线粒体及卵巢衰老相关的Hspd1和Ndufad1蛋白在Met+hUC-MSCs组显著高表达。 结论： 1. 本实验方法获取的脐带间充质干细胞具有干细胞特性，细胞鉴定合格； 2. hUC-MSCs移植可延缓小鼠卵巢衰老，改善卵巢功能； 3. 二甲双胍处理可增强hUC-MSCs干性； 4. Met+hUC-MSCs移植可减少卵巢凋亡，延缓卵巢衰老，改善自然衰老小鼠卵巢功能，且作用强于未经二甲双胍处理的hUC-MSCs； 5. Met+hUC-MSCs可能通过线粒体相关通路上的Hspd1和Ndufad1蛋白发挥作用，延缓卵巢衰老，改善卵巢功能。
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