摘要
因丰富的次级代谢产物而闻名的链霉菌，在作为底盘细胞用于重组蛋白分泌表达方面也具有明显的优势。现有研究表明，相比于大肠杆菌等其它模式细菌，链霉菌中蛋白分泌在转录后和翻译后水平受到更为复杂的调控，而目前对该阶段的调控机制还缺乏认识。这一现状造成了在高效分泌工程菌株构建的过程中所采用方法手段的局限性。一些模式微生物中的研究表明以AAA+蛋白酶为主角的蛋白质量控制系统参与了蛋白分泌过程的调控。链霉菌中具有丰富的AAA+蛋白酶。本研究围绕链霉菌中AAA+蛋白酶在蛋白分泌中的调控作用展开，主要研究内容和取得的成果如下： （1）荧光素酶报告系统的建立：采用密码子优化的、来自海洋桡足动物Gaussia princeps 的荧光素酶编码基因（Gluc）为报告基因，在启动子 Pvsi 驱动之下，分别融合Sec途径信号肽和Tat途径信号肽，以链霉菌质粒pLH711（pKC1139）为载体，分别构建Gluc分泌表达质粒pLH1857和pLH1858，二者共同构成了荧光素酶报告系统。 （2）AAA+蛋白酶编码基因失活突变库的构建与筛选：本研究采用链霉菌基因组无痕编辑技术对AAA+蛋白酶编码基因（clpP1，clpP2，clpP3，ftsH，ftsH3，lon，pr cA，clpP4，clpP5）进行基因失活突变，并成功获得相应的突变菌株（S3249，S3250， S3251，S3254，S3255，S3256，S3257，S3252，S3253）。采用荧光素酶报告系统对各 AAA+蛋白酶突变菌株的 Gluc 分泌效率进行检测，与野生型背景相比，在基因敲除突变株 S3250（ΔclpP2），S3254（ΔftsH），S3255（ΔftsH3）中， Sec 途径和 Tat途径依赖的Gluc分泌都得到了显著的提升。其中，相比于在野生型背景，Gluc的分泌在S3250（ΔclpP2）菌株中提升幅度最大， Sec途径依赖的分泌提高了 209.3 倍，T at途径依赖的分泌提高了93.7倍。 （3）透明质酸酶在底盘细胞 S3250（ΔclpP2）， S3254（ΔftsH），S3255（ΔftsH3）中的分泌表达：本研究采用筛选到的优势底盘细胞进行透明质酸酶的异源表达，与报告系统表征的结果一致，透明质酸酶在三株底盘细胞中的表达相比于野生型有不同程度的提高，最高是野生型菌株的2.1倍，同时也验证了底盘细胞的普适性。 总之，本研究建立了用于监控链霉菌重组蛋白分泌表达的荧光素酶报告系统，通过对AAA+蛋白酶突变库的筛选，获得了具有荧光素酶高效分泌特征的突变体，这些突变体在重组蛋白高效分泌表达方面具有潜在的应用价值。上述研究有助于完善对链霉菌蛋白分泌过程在翻译后水平所受调控的认识，为推动链霉菌蛋白表达系统从实验室走向工业应用提供理论和技术支撑。
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