摘要
红曲菌能够产生红曲色素等有益的次级代谢产物。氮源作为红曲菌主要的营养元素，直接影响红曲菌的生长繁殖以及次级代谢等过程。目前，红曲菌的氮代谢转录调控方面的研究还不够完善。AreA基因作为氮代谢全局转录调控因子，参与次生代谢的调控。本文以Monscus ruber C100为出发菌株，研究了MAreA基因对红曲菌生长繁殖以及色素代谢的影响，并通过RT-qPCR技术检测生长发育以及色素生物合成关键基因的相对表达量，进而预测MAreA基因的功能。主要研究结果如下： （1）MAreA基因的敲除和过表达 首先设计特异性引物，从M. ruber C100中克隆出长度为2670bp的MAreA基因，然后筛选出了敲除菌株ΔMAreA和过表达菌株OE-MAreA。 （2）ΔMAreA菌株和OE-MAreA菌株生长发育分析 ΔMAreA菌株的生长速度和产孢率明显受到抑制，菌丝体纤细且荧光强度较弱；而OE-MAreA菌株生长速度与原始菌株C100差别不大，产孢率增加，菌丝体表面附着更多的代谢产物且荧光强度较强。对比不同氮源条件，优先氮源条件下的ΔMAreA和OE-MAreA的生长明显优于次级氮源。 （3）ΔMAreA菌株和OE-MAreA菌株固态发酵产红曲色素分析 ΔMAreA菌株色价降低了7.5%而OE-MAreA菌株色价则升高9%。对比不同氮源条件下，ΔMAreA菌株可以利用优先氮源（Gln和(NH4)2SO4），使其色素产量和原始菌株C100差别不大。但是不能很好的利用NaNO3和Urea等次级氮源，其色素产量较C100分别下降了46.2%和23.3%。不同氮源条件下，OE-MAreA菌株色素色价较C100均有不同程度上的增加。 MAreA基因的敲除和过表达不会影响六种主要色素的种类，但是会影响其含量。其中，变化最明显的为橙色素和红色素，黄色素含量基本不变。当发酵培养基中加入优先氮源时，红色素R1、R2含量增多，橙色素O1、O2含量下降；当培养基中加入次级氮源Urea时，红色素R1、R2含量最多，基本检测不到橙色素。 （4）ΔMAreA菌株和OE-MAreA菌株基因表达量分析 对红曲色素基因进行分析，ΔMAreA菌株mppE的基因表达量明显上调，而MpPKS5、mppD基因相对表达量下调；OE-MAreA菌株4个基因表达量均下调。对生长调控基因进行分析，ΔMAreA菌株明显降低了VosA和LaeA基因表达量，而MAreA基因的过表达对GprD基因促进作用明显。并且在次级氮源NaNO3的培养基中，4个基因表达量受到明显抑制。
NETL