摘要
自然界中干旱和盐胁迫，严重威胁了作物的安全、产量和质量。植物体内六大激素之一的ABA(absicsic acid)，在植物响应环境的各种非生物胁迫（干旱、高盐和冷害等）中起到重要的作用。在早期的工作已经表明锌指蛋白转录因子ZFP36参与了水稻中ABA诱导的抗氧化防护的机理中，在干旱和盐胁迫中起着一个正调控的作用。OsDjC46蛋白具有一个保守的DnaJ结构域的蛋白，因而被称为DnaJ蛋白，同时它是一类热激蛋白。热激蛋白是一类可以增加植物抗逆性的蛋白质分子，同时它可以作为活性氧的清除剂，减少植物的氧化胁迫。现在暂时没有关于OsDjC46是否参与由ABA诱导的抗氧化防护的相关报道。本文 以ZFP36为诱饵进行酵母筛库实验，以此获得ZFP36的互作蛋白：DjC46。蛋白DjC46是一个热激蛋白，通常以分子伴侣的形式存在。热激蛋白已被证实可以增加植物对逆境抗性，在多种胁迫下热激蛋白被诱导产生，对蛋白不正常折叠和聚集有阻止作用，从而使植物的内环境保持稳定。DjC46蛋白具有保守的DnaJ结构域，人们也称这类蛋白为DnaJ蛋白。酵母双杂假阳性比较高，因此采用COIP、BiFC和GST pull-down这三种方法更深入的验证OsZFP36和OsDjC46互作的真实性。三个结果分别从体内体外的角度证明了OsZFP36和OsDjC46均存在互作。同时利用亚细胞定位得到，OsZFP36和OsDjC46均在细胞核中定位，这是一个侧面证据说明两者互作的可能性。 OsDjC46受ABA诱导，在水稻幼苗期外源添加ABA，DjC46的表达量上调，同时采用H2O2处理幼苗，起峰时间比ABA处理后起峰时间早，暗示着ABA对DjC46基因的诱导可能与H2O2有关。使用DPI、CAT、DMTU这些H2O2清除剂和抑制剂预处理水稻幼苗再用ABA进行诱导，DjC46基因的表达量没有明显上调。这可能是水稻热激蛋白DjC46基因的表达可能受ABA信号通路产生的内源H2O2影响。Ca2+作为植物体细胞内信号传导的第二信使，与植物对胁迫环境的应答反应密切相关。在ABA信号传递中已被证明Ca2+是其重要的成员。CaM、CBL、CDPK等钙离子受体可以对Ca2+信号进行传感来参与ABA的信号传导。用具有Ca2+的溶液处理水稻幼苗再通过荧光定量发现其可以诱导基因DjC46的表达，而用钙离子相关的抑制剂和清除剂对幼苗处理后添加ABA进行诱导，基因DjC46的表达没有上调的趋势。这个发现可能暗示DjC46参与ABA有关的信号传递与钙离子的存在有着密切关系。SOD、CAT和APX这些与抗氧化相关的防护酶的活性增加是植物参与抗氧化应答的体现。构建OsDjC46瞬时表达载体和合成OsDjC46的干扰片段。提取水稻的原生质体，利用瞬时表达系统瞬时表达DjC46，抗氧化酶SOD、CAT和APX的活性增加，经ABA诱导的酶活性增加的幅度更大。瞬时沉默DjC46，SOD、CAT和APX的酶活性显著下降。外源添加ABA也不能促使SOD、CAT和APX的活性恢复。在转录水平上的结果也是一致的，说明OsDjC46与抗氧化防护反应密切相关。 同时采用遗传材料进一步证明参OsDjC46与植物的抗逆应答，利用CRISPR/Cas9系统和农杆菌介导的方法来构建OsDjC46敲除和过表达材料。利用材料进行耐逆性相关生理指标测定，包括SOD、CAT、MDA、相对含水量和脯氨酸等。当OsDjC46敲除掉后，水稻中SOD和CAT的活性降低，而过表达植株中其活性增加。MDA是细胞膜受损后质膜过氧化的一个产物，反映了其受损程度，而叶片电导率同样可以反映细胞膜受损情况和其透性改变情况。与野生型相比，敲除材料的MDA含量更高，而过表达材料中的MDA的含量减少。电导率结果与MDA结果一致，在逆境胁迫下DjC46对植物抗性的增加的效果。同样相对含水量的结果也进一步证明DjC46参与与干旱、盐胁迫相关的应答过程，可以提高植物耐逆性。植物体内的脯氨酸是一个重要的抗逆指标，它既可以通过改变细胞的渗透压来减少渗透胁迫，同时可以作为活性氧的一个清除剂来减少氧化胁迫。干旱盐胁迫环境下，DjC46敲除材料中的脯氨酸含量最低，这说明其受到的伤害最大。用ABA处理突变体材料的种子，观察其萌发率可知，水稻DjC46过表达与敲除材料对ABA敏感度较强烈。同样用ABA处理萌发后的材料发现，过表达材料的根比较粗短，敲除材料的根比较细长，过表达材料对ABA更加敏感。采用NaCl和PEG进行模拟盐胁迫和干旱环境，对二叶期的水稻突变体材料处理发现DjC46过表达材料抗逆性最强，这直接说明了DjC46增加了植物的抗逆性。 同时分析DjC46和ZFP36在抗氧化防护途径的关系，通过利用两者突变体材料进行荧光定量分析可知，DjC46位于ZFP36上游。将OsDjC46克隆的YFP载体上和OsZFP36克隆到mCherry载体上，同时将两个载体转入原生质体中发现两者共同定位于原生质体的细胞核中，在洋葱表皮细胞进行的共定位实验结论也一样。这也是一个侧面的证据说明两者互作的可能性。使用MAPKK的抑制剂PD98059和U0126处理水稻幼苗，OsDjC46基因表达量也不再受ABA诱导，这可能是ABA诱导的DjC46基因的转录受MAPK级联系统调控。利用OsMAPK1和OsDMI3突变体材料进行RT-PCR实验可以初步知道 OsDjC46位于 OsMAPK1和OsDMI3 下游，同时使用CRISPR/Cas9得到的OsDjC46敲除材料检测的OsMAPK1、OsMAPK5、OsDMI3的表达量，可以进一步说明了OsMAPK1、OsMAPK5、OsDMI3在OsDjC46上游位置。通过网站分析DjC46蛋白的DnaJ结构域位于C端，而它与ZFP36的互作位点是否在其DnaJ结构域中就尚不清楚。将DjC46蛋白的DnaJ结构域截取出来，将其分成N端和C端两个片段，分别克隆到酵母载体BD上，通过酵母双杂实验发现，DjC46蛋白和ZFP36蛋白互作的位点并不在DnaJ结构域里，而是位于OsDjC46的N段位置。
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